缺血性心脏病的再生治疗——聚焦心脏干细胞

马根山

心肌梗死导致心肌细胞丢失、疤痕形成、心室重塑并最终导致心力衰竭。药物治疗、介入治疗和外科手术的进步使冠心病心肌梗死患者的急性期死亡率明显降低，但却不能使心肌细胞重生，不能解决导致心室重塑、心功能下降的根本问题，因此在心肌梗死死亡率下降的同时伴随着心肌梗死后心力衰竭的发病率和死亡率的升高。细胞治疗的目的是心肌再生和新生血管形成，进而改善临床治疗效果。细胞疗法有可能防止甚或逆转心力衰竭的病理生理进展，是一个有潜力的新的治疗方法。虽然胚胎干细胞可以分化为心肌细胞和构建新血管所需的所有细胞类型。然而，除了伦理学原因(因为有成瘤的可能)至今还没有任何一个临床研究用胚胎干细胞来进行心脏再生。

1 心肌细胞的更新

传统的观念认为心脏是一个终末分化器官，心肌细胞的数量在出生时就已固定了。然而，近年来的研究发现在胎儿、新生儿、成人及肥大心脏中心肌细胞具有有丝分裂现象，暗示心肌中存在一个原始的、未分化的细胞群。这一发现揭示了一个截然不同的新的心脏生物学观念，认为在出生后的生命过程中包括成年期和老年期一直存在心肌细胞生成，心脏在整个生物体生命过程中具有显著的生长储备。

2009年Bergmann等［1］发现由于冷战时期过度的核试验，14C的浓度在不同年龄层次的人群中有显著的差异，通过检测人体心肌细胞核内14C浓度的变化，发现成人的心肌细胞一直在更新，在25岁左右时心肌细胞的年更新率为1%，到75岁时年更新率为0.45%，在人的一生中，有约50%的心肌细胞更新过了。2010年，Kajstura等［2］研究心肌细胞及心脏干细胞的增殖、老化、凋亡及端粒长度，发现女性心肌细胞的年更新率在20岁时为10%，60岁时为14%，100岁时为40%，与之相对应的，男性心肌细胞的年更新率分别为7%、12%、32%。这个研究说明随着生命个体的老化，心肌内实质细胞的数量逐渐显著增加。从20岁到100岁，女性心肌细胞更新了15次，而男性11次。这些研究均证实人类心脏是一个动态器官，其本身的心脏干细胞群调节着心脏的内稳态，并控制着器官的老化。

2 心脏固有干细胞

自2002年Hierlihy等［3］首次报道在成体心肌中鉴别出了一个固有祖细胞池后，一些实验室也相继从成体心脏中分离并鉴定出心脏干/祖细胞，并证明这些细胞具有能分化为心脏中所有的主要细胞类型的能力，包括内皮细胞，平滑肌细胞和心肌细胞［4－7］。心脏干细胞(cardiac stem cells，CSCs)位于心脏内，可以天然的程序性的重组心脏组织，这些细胞影响着出生后心脏的改编。在没有损伤的情况下，CSCs也为生理性的心脏细胞更新提供新的心肌细胞。因此，心脏干细胞具有再生梗死心脏的潜能，它们本质性的适合于生成心脏组织并增强心脏组织活力，在探索心脏再生治疗方面CSCs优于其他干/祖细胞，是一个合理的种子细胞。

CSCs是未分化细胞，它们中的一些表达早期心肌细胞系的转录因子(Nkx2.5，GATA-4，MEF2)。CSCs可通过几个表面标记如c-kit、Scal-1、MDR1、Isl-1等检出，但这些表面标记并非CSCs特有。CSCs与其他干细胞不同，它们是典型的Lin－，CD34－和CD45－。目前，研究者们以不同的干/祖细胞抗原为基础已从成体心脏组织中分离、扩增出未分化细胞，包括c-kit+细胞、sca-1+细胞、侧群(side population，SP)细胞、心球样细胞和Islet+心脏祖细胞。

3 c-kit+心脏干细胞

c-kit+细胞已被证实是心脏的组成成分，它们的激活导致了新的心肌的生成［8－9］。c-kit+的心脏干细胞是到目前为止研究得最彻底的心脏干/祖细胞群。c-kit，干细胞因子，是一个许多成体干细胞都有的共同干细胞标记。2003年，Beltrami［4］等首次从成体心脏中分离出c-kit+心脏干细胞并系统地描述了它们的特性。c-kit+心脏干细胞表达许多谱系标记，如GATA-4，GATA-5，Nkx2.5和MEF2，而不表达骨骼肌系、血细胞系和神经系的表面标记，它们位于心肌细胞的间质部位，以心房和心尖部密度较高。

2007年Bearzi等［10］报道人类手术标本中鉴定出c-kit+心脏干细胞，类似于动物模型中所显示的，人c-kit+心脏干细胞在体外显示出自我更新、形成克隆和多向分化潜能，并且可以移植进正常和受损心脏。新生的心肌细胞、毛细血管和动脉被鉴定出是人类起源的［10］。

4 Sca-1+心脏干细胞

Sca-1，干细胞抗原1，是造血系干细胞的共同标记，不过它也表达在许多干细胞、祖细胞和不同组织中分化了的细胞上［11］。在c-kit+心脏干细胞报道的同时，Oh等［6］报道在成体小鼠的心脏内鉴定出Sca-1的心脏祖细胞，并且证明在体内和体外这些细胞能分化为心肌系细胞。Matsuurra等［12］研究发现鼠类心脏Sca-1+细胞在催产素的刺激下能分化为自发性收缩的心肌细胞。催产素刺激2周后，大多数Sca-1+细胞迅速复制为高核/浆比例的小圆形细胞。这些结果表明成体鼠心脏内的Sca-1+细胞具有干细胞潜能，并可促进受损心脏的再生。在Sca-1+细胞和心脏SP细胞之间有较大的重叠，超过70%的心脏SP细胞同时也表达Sca-1。Pfister等［13］研究显示具有分化为心肌细胞能力的Sca-1+细胞多为也表达SP细胞表型的细胞。

5 心球衍生的心脏干细胞

Messina等［5］是最先描述小鼠及人类心脏活检标本中另一心脏祖细胞群体的人。这些细胞在特殊培养条件下能形成细胞球，称之为心球。免疫表型分析显示心球是由不同种类的细胞群组成的，表达许多内皮细胞标记(如KDR、flk-1和CD31)和干细胞标记(如c-kit、Sca-1和CD34)［5］。与其他的心脏干/祖细胞群相似，这些心球细胞也显示了所有心脏干细胞本质特性，因为它们能自我更新，能分化为心脏系和内皮系细胞。而且，植入心球细胞能改善心肌梗死后小鼠的心脏功能并生成心肌细胞和内皮细胞。

6 SP细胞

另一种心脏干细胞群称为SP细胞。SP细胞在几种成人组织中发现，它们能分化为其起源组织的器官特异性细胞［14］。心脏SP细胞不同程度的表达几种干细胞因子(Sca-1+，c-kit+)，它们是CD31－，CD34+，CD45－。当与心脏细胞在心肌细胞特异性培养液中共培养后，心脏SP细胞能表达α-肌动蛋白，表示其已分化为心肌细胞［12］。它们也表达几种转录调节器，包括细胞周期调节器如Notch和TGF-β，暗示其象胚胎干细胞一样具有自我更新的能力。这些SP细胞作为一个祖细胞群具有发生、维护、修复心脏的作用。

7 心球样细胞

2004年，另一个具有心脏干细胞特性的细胞群从心脏组织中分离出来，这些自我黏附的未分化细胞球称为心球样细胞，从出生后的人类或鼠类的心房或心室活检标本培养得到，呈自我黏附的球样生长。免疫表型分析显示心球是由不同种类的细胞群组成的，表达许多内皮细胞标记(如KDR、flk-1和CD31)和干细胞标记(如c-kit、Sca-1和CD34)［5］。与其他的心脏干/祖细胞群相似，这些心球细胞也显示了所有心脏干细胞本质特性，能自我更新，能分化为心脏系和内皮系细胞。而且，植入心球细胞能改善心肌梗死后小鼠的心脏功能并生成心肌细胞和内皮细胞。

8 Isl-1+细胞

在新生的啮齿类和人类心脏中，发现心脏干细胞并不表达c-kit和Sca-1，而是通过表达转录因子islet-1来辨别它们［15］。它们也表达那些在心脏发生早期出现的因子如Nkx2.5、GATA4。当与新生的心肌细胞共培养时，这些细胞将分化并接受心肌细胞表型，包括电活性和收缩性。Isl-1+细胞的临床应用似乎是有限的，因为它们稀少，到目前为止只有在新生儿的组织中才能被检测到。

9 心脏干细胞进行心脏修复的实验证据

第1个心脏修复的实验证据来自Quaini等［9］的观察报道。在性别差异配对的心脏移植术后对器官移植受体的分析中发现，人体内存在一个循环干细胞池，这些干细胞能分化为心肌细胞、冠状动脉、毛细血管。在一个移植了女性捐赠者心脏的男性患者身上发现，受体的原始细胞已异位到移植的心脏上。Y染色体被用来检测表达干细胞抗原(Sca-1、c-kit、MDR1)的移行的未分化细胞，并用来区别受体的原始细胞和来自供体的原始细胞。在供体的心脏中有7%～10%的心肌细胞Y染色体是阳性的，而且这些细胞处于高增殖状态。

2002年，Anversa和Nadal-Ginard［16］报道将雌性小鼠的心脏移植进雄性小鼠的体内后，移植后的心脏细胞中发现含有Y染色体［16］。Hsieh等［17］发现心肌梗死3个月后，梗死边缘区有15%的心肌细胞是来自内源性的心肌干/祖细胞池。这些现象清楚地表明成年哺乳动物心脏有再生能力。可诱导Cre-Lox细胞谱系追踪技术提供了一个可信服的证据，证明新形成的心肌细胞不是来自于原先就存在的成熟心肌细胞，而是来自于心肌干/祖细胞。

Beltrami等［4］通过BrdU标记观察到心脏干细胞再生了心肌，特征性表现为由年轻细胞组成的血管及心肌，最大可包绕心室的70%。心脏超声检查显示左心室射血分数在20 d时与安慰剂组比较有显著改善［(34±3)%vs(45±10)%］。Dawn等［18］通过冠状动脉介入输注1×106c-kit+细胞。5周时，与对照组比较左心室功能明显改善［(38.9±2)%vs(48.4±2)%］，并减少约29%心肌梗死的面积。Bearzi等［10］用免疫缺陷小鼠(n=25)和免疫抑制的大鼠(n=19)做实验，心肌梗死后，输入的人CSCs能形成一个嵌合体的心脏，它包含由心肌细胞、冠状动脉和毛细血管组成的心肌层。超声心动图和血流动力学检测证实这些新生心肌在结构和功能上都与原啮齿类动物的心脏融为一体，共同维持心脏功能。Wang等［19］研究发现CSCs移植后3周，小鼠梗死心脏左心室射血分数上升，舒张末期和收缩末期容积下降，心肌新生血管生成明显增多，伴随着一定的心肌细胞再生。证明CSCs能使心功能下降减弱，不利的心脏结构重塑减轻。这些研究显示了CSCs临床应用的可能。

近来，研究者们已确定了从不同种属心肌样本中分离、扩增c-kit+的CSCs的条件。人CSCs主要分化为心肌细胞，少部分分化为平滑肌细胞和内皮细胞［10］。CSCs具有治疗心力衰竭的潜能，在临床各类缺血性或非缺血性心力衰竭患者中，可以在体外分离、扩增CSCs，自体移植到患者体内，再生新的心肌组织取代以前无活力的心肌［20－23］。可是分离出c-kit+心脏祖细胞的能力各家报道并不一致，最近的一个报道表示从不同的心脏活体检查组织中分离出(1～3个细胞/mm2)足够数量的c-kit+细胞很困难［24］，而Kubo等［25］报道他们从37个人类心脏中的36个分离出了足够数量的c-kit+心脏干细胞，并在体外证明它们具有分化为心肌细胞的能力。更重要的是，c-kit+心脏干细胞群已经通过了新药研究审核，目前正处于使用自体心脏干细胞进行人干细胞临床实验前期准备的最后阶段。

10 结 语

未来细胞疗法的研究重点主要是以下几个问题:第一:其临床治疗效果的确切机制，是再生形成新的心肌和血管，还是由于旁分泌效应?第二，什么是细胞输入的最佳方法?第三，如何让移植细胞在我们感兴趣的区域达到最佳的分化和存活?心脏干细胞可以天然的程序性的重建心脏组织，且更易于与原有心肌融为一体。心脏干细胞的研究将会改变心脏疾病的基本治疗途径，这将会改善数百万缺血性心脏病患者未来的生活质量。

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