牛支原体病综合防制措施

韩潇潇 陈颖钰 郭爱珍 *

1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.华中农业大学动物科技学院，武汉 430070；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070

牛支原体是一种能够引起肉牛和奶牛多种疾病的重要病原体，也是牛呼吸道综合症的重要病原体之一。牛支原体除了导致肺炎、乳腺炎外，还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病[1]。在临床病例中牛支原体引起的疾病没有典型症状，且常常与其他多种致病菌混合感染，与其他疾病难以区分，所以极易被忽视。自l961年在美国首次分离到支原体以来[2]，全世界大多数国家都已经发生过牛支原体相关疾病的疫情；我国在2008年也首次报道了牛支原体肺炎的疫情，发病率为50%～100%，病死率高达10%～50%，造成了巨大的经济损失[3-4]。

1 病原学

牛支原体属于柔膜体纲支原体目支原体科支原体属，是一类缺乏细胞壁、具有高度形态多样性、可通过滤菌器并能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物[5]；牛支原体基因组大小为1080kb，G+C含量为27.8%～32.9%，牛支原体和牛无乳支原体基因组非常相似，在16SrRNA上有99%的同源性[1]。

牛支原体一般寄生在黏膜表面，主要寄生于鼻腔，其次在乳腺。牛支原体在环境中的存活力较其他支原体稍强，如在避免阳光直射条件下可存活数周，在4℃牛奶和海绵中可存活2个月；在水中可存活2周以上；在20℃时，其存活时间降至1～2周，在37℃时其存活时间降为1周；牛支原体在65℃2min、70℃ 1min可灭活；但4～37℃范围内在液体介质中可存活59～185d；在其他材料中的存活时间是：粪 37d，棉 18d，秸秆 13d，木和不锈钢 1～2d[6]。

2 流行病学

牛支原体自然感染的潜伏期较难确定。国外有报道，在健康犊牛群中引入感染牛24h后，就有犊牛从鼻腔中排出牛支原体，但大部分牛在接触感染牛7d后经鼻腔排出牛支原体。有的牛在接触感染牛2周后发病[3]。我国牛支原体病的暴发几乎都与运输有关，多数牛在运输到目的地后1周左右发病，如在途中遭遇雨淋等不良环境影响，牛可在运达目的地后第2天即发病。感染牛支原体的牛可携带病原体数月甚至数年而成为一个传染源。主要传播途径是通过飞沫经呼吸道传播，近距离接触、吮吸乳汁或生殖道接触等也可传播牛支原体[7]。

牛支原体通常和其他病原体混合感染。常见的混合感染细菌有多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和昏睡嗜血杆菌。常见的混合感染病毒有牛疱疹病毒l型或牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒和牛呼肠孤病毒等[6]。这些病毒可诱导免疫抑制，促使细菌性病原增殖并下行至肺，引发肺炎。

异地运输、饲养方式或环境条件改变等应激因素是牛支原体肺炎的诱发因素，同时牛支原体感染对机体免疫系统造成极大破坏，也进一步促进继发感染或混合感染的病原微生物的致病作用。除细菌和病毒的混合感染外，血孢子虫感染可能对牛支原体肺炎的发生也有促进作用[3]。

3 临床症状和病理变化

牛支原体感染牛只后，往往会引起慢性肺炎症状，病程较长，发病初期体温升高至42℃左右，病牛精神沉郁、食欲减退、咳嗽、气喘、清晨、半夜或气温转凉时咳嗽剧烈，有清亮或脓性鼻汁，严重者食欲废绝，病程稍长时患牛明显消瘦，被毛粗乱无光；有的患牛继发腹泻，粪呈水样或带血；有的患牛继发关节炎，表现跛行、关节脓肿等症状；也有病牛继发结膜炎，眼结膜潮红，有大量浆液性或脓性分泌物。严重者出现死亡，犊牛病情相对严重，病死率可达50%[3，6]。

剖检病理变化主要集中在胸腔与肺部。肺和胸膜发生不同程度粘连，有少量积液；心包积水，液体黄色澄清；肺发生不同程度地病变，可能与病程及机体抵抗力有关。轻者可见肺尖叶、心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散在分布；严重者可见肺部广泛分布有干酪样或化脓性坏死灶。病理组织学观察可见支气管肺炎或化脓性坏死性肺炎，或凝固性坏死性肺炎[3，6]。

4 诊断方法

4.1 病原体的分离鉴定

按照无菌操作规程将小块组织样本涂于类胸膜肺炎微生物（PPLO）和适当抗生素的固体培养基表面，于体积分数为5%的CO2培养箱中，同时将小块组织样本投入到PPLO液体培养基中。2～3d后在光学显微镜下低倍观察菌落形态，支原体菌落应具有“煎蛋样”典型特征，液体培养基由红色变为黄色且透亮[6]。

4.2 基因检测

牛支原体基因检测方法主要是PCR方法。由于牛支原体和牛无乳支原体同源性很高，所以仅仅使用PCR检测16SrRNA的扩增片段无法区分牛支原体和牛无乳支原体，需要使用RT-PCR、杂交探针和解链温度分析等辅助才可以快速灵敏地区分这2种病原。此外，PCR扩增16SrRNA后，再进行变性梯度凝胶电泳也可以快速鉴别出这2种病原[8]。根据牛支原体特异性基因UvrC建立的环介导等温核酸扩增检测（LAMP）方法，具有较高的特异性和灵敏性，为牛支原体的快速诊断提供了方法[9]。

4.3 血清学检测

牛支原体血清学检测方法包括间接血凝试验、生长抑制试验、间接酶联免疫吸附试验等，用处理过的牛支原体全菌蛋白作包被抗原的间接ELISA是当今最主要的血清学检测方法。在欧洲等国家已有商业化的ELISA试剂盒出售，其敏感性和实效性都比传统的培养方法好得多，可用该法评价牛支原体血清抗体阳性率和建立无牛支原体感染牛场[10]。一种针对牛支原体全菌裂解物的单克隆封闭抗体作为目标抗原的封闭ELISA方法，在检测牛支原体血清抗体时具有高度特异性、敏感性、较少的背景干扰和交叉反应[11]。

4.4 免疫组化

免疫组化是一种敏感、特异的鉴定病原的方法，该方法主要优点在于可以检测到支原体抗原在体内的分布情况；特别是在其他方法表明牛支原体存在，但病原培养又为阴性时，免疫组化就显得更为重要[12]。在干酪样坏死性支气管肺炎的组织损伤中，免疫组化结果表明牛支原体抗原遍布于干酪样坏死灶处，但是在坏死灶周围尤其显著；抗原主要在巨噬细胞的胞浆内，在坏死物质中没有。抗原同时也存在于肺泡和支气管腔内的巨噬细胞、嗜酸性细胞和中性粒细胞内[13]。

5 疫苗研究进展

虽然牛支原体是引起犊牛肺炎、乳腺炎和关节炎的主要致病菌，但目前还没有特别有效的牛支原体疫苗[1]。由于牛支原体对抗生素的敏感性较差，所以使用疫苗预防将会是一种较为理想的控制方法。但目前除美国外，几乎没有商业化疫苗用于牛支原体病的预防，一些商业化的疫苗（包括2株预防牛肺炎的疫苗Pulmo-GuardTMMpB和Myco-BacTM B，1株预防乳腺炎的疫苗 MycomuneTM）虽已在美国应用，但没有任何文献报道可以说明这些疫苗是否有效。在欧洲，一种包括牛支原体在内的四价灭活苗可以提供一定的预防效果。另一种有高免疫源性的皂苷灭活疫苗可以对攻毒后动物提供较高的保护力，免疫后的牛临床症状较轻微，体温、肺部病变、体重消长等指标与未免疫牛有较显著差异，且免疫牛对支原体在体内的扩散有一定的抑制作用[14]。所以就目前看来，牛支原体还缺乏一种真正的商业化疫苗来防止该病的发生。

6 综合防制措施

6.1 治疗

“早诊断，早治疗”是有效控制本病的基本原则。有牛场证实在牛群引进后立即进行全群治疗，可明显降低发病率和死亡率。早期应用抗生素治疗牛支原体病有一定效果，但应保持足够用药量和用药疗程[15]。牛支原体无细胞壁，对作用于细菌细胞壁的β-内酰胺酶类抗菌药物（如青霉素和头孢类药物）不敏感，因此应选用作用于细菌蛋白质合成的相关药物。另外，牛为反刍动物，药物内服效果相对较差。实验室药敏试验结果证实牛支原体的敏感抗生素有四环素类、替米考星或壮观霉素等。牛支原体对喹诺酮类药物（如环丙沙星、泰乐菌素类药物）也敏感。但临床用药经常与实验室结果出现差异，这可能与牛支原体耐药性、混合感染、病程等多种因素有关[3]。

6.2 预防

1）加强牛群引进管理和检疫。不从疫区或发病区引进牛，尽量减少远距离运输，减少交易环节。牛群引进前应做好牛支原体病、牛结核、泰勒虫病等病的检疫检测，防止引进病牛或处于潜伏感染期的带菌牛。在产地完成预防接种，防止引进病牛和带菌牛。牛群引进后应进行隔离观察，确保无病后方可与健康牛混群，定期对牛群进行血清学检查以便及时掌握本病在牛群中的流行情况。在有条件的情况下，进行“自繁自养”，这是控制疾病流行的较好方法。育肥牛群采用全进全出制度，在空栏期要对牛舍进行彻底消毒。

2）加强牛只的饲养管理，减少环境应激。保持牛舍通风良好、清洁、干燥。牛群密度适当，避免过度拥挤。不同年龄及不同来源的牛应分开饲养。适当补充精料与维生素及矿物元素，保证日粮的全价营养。确保犊牛至少在运输前30d断奶，并已适应粗饲料与精饲料喂养。定期消毒牛舍，及时发现与隔离病牛，尽早诊断与治疗。

7 结 语

牛支原体病是呈世界性分布的重要传染病，尤其在养牛业发达的国家，这种疾病的发生更为严重，给养牛业造成了巨大的经济损失。随着我国牛养殖量的增加，饲养方式向规模化和集约化等现代养殖模式转变，我国养牛业受该病的威胁也越来越大。现阶段国内外对牛支原体研究不深入也不透彻，因此需要投入更多的人力、物力深入研究牛支原体病的免疫和致病机制，开发有效的诊断试剂及疫苗，有效防控牛支原体病，保障养牛业健康、快速发展。

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