淫羊藿苷通过雌激素受体和p38MAPK信号诱导MC3T3-E1Subclone14细胞的分化

朱晓峰 张荣华 孙升云 王廷春 王攀攀 杨 丽 韩 莉

(暨南大学附属第一医院中医科，广东 广州 510630)

淫羊藿苷(ICA)为淫羊藿的主要活性成分，也是对含淫羊藿药物质量控制的主要指标性成分〔1〕，分子式为C33H40O15，结构上属于8-异戊烯基黄酮醇苷类化合物。目前研究发现ICA有多种药理活性，尤其对骨代谢的作用研究较多，已有的结果显示ICA可以促进成骨细胞和间质干细胞分化〔2，3〕，抑制破骨细胞的分化和成熟〔4〕，但对其具体的作用靶点和作用机制缺乏进一步研究。雌激素受体(ER)信号通路和p38MAPK信号和成骨细胞的分化有着密切关系，一些植物的活性成分显示可以通过这两个信号影响成骨细胞分化〔5，6〕，那么ICA是否有类似作用，ER信号通路和p38MAPK信号有无联系?本研究的实施可以为淫羊藿的补肾壮骨作用提供部分细胞分子学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 无酚红的αMEM(Gibco);碳吸附的胎牛血清(FBS)(Biological Industries);抗坏血酸(Vit C)、二甲基亚砜(DMSO)、pNPP、茜素红(Sigma);ICI182780(Tocris Cookson);WST-8试剂盒(GEMED基因);BCA蛋白检测试剂盒(凯基生物科技);I型胶原(Col I)ELISA试剂盒(森雄科技);骨钙素(BGP)ELISA试剂盒购于(西唐生物科技);ECL发光试剂盒(PIERCE);PMSF(Sigma);β-tublin兔抗小鼠一抗(Cell signal);SB203580(Invitrogen);p38兔抗小鼠一抗和P-p38兔抗小鼠一抗(Cell signal);羊抗兔二抗(Santa Cruz);Model 680型酶标仪、垂直和转移电泳槽(Bio-Rad);图像分析系统(LEICA)。

1.1.2 实验药物 淫羊藿苷，分子式为 C33H40O15，分子量676.65，淡黄色结晶，购于中国药品生物制品检定所，批号：200414，含量98%(HPLC检测)。

1.1.3 实验细胞 小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14细胞(MC3T3-E1Subclone14)，购于中国科学院细胞库(ATCC CRL-2594)。

1.2 方法

1.2.1 实验药物的制备 取ICA 20 mg，先用少量DMSO溶解，然后再配制成含有不同浓度的培养基，对照组培养基中添加同等浓度的DMSO，实验各组DMSO的量均小于0.1%。

1.2.2 MC3T3-E1Subclone14细胞培养 MC3T3-E1Subclone14细胞复苏，置于37℃，5%CO2培养箱培养，细胞分化实验培养液条件为含有10%碳吸附的胎牛血清(FBS)、20 mmol/L HEPES、50 μg/ml VitC、5 mmol/L β-甘 油 磷 酸 钠 ( β-GP)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml青霉素的无酚红的 αMEM 培养基〔7〕，每3 d 换液一次。

1.2.3 WST-8检测细胞活力 细胞消化后以每孔1×104个接种至96孔板内，细胞贴壁后换无血清无酚红的αMEM培养液培养24 h，再更换含 ICA(10-7、10-6、10-5mol/L)的培养液或对照液，培养48 h或72 h，每孔加入10 μl的WST-8试剂，置培养箱中孵育1 h后，酶标仪490 nm波长处检测吸光度(OD)值。

1.2.4 pNPP法检测细胞 ALP活性 细胞消化后以5×104个/ml的密度每孔3 ml接种到6孔板中，含10%碳吸附FBS的αMEM培养3 d，细胞同步化后更换为含ICA各组培养液或对照液，培养48 h，吸弃培养液，加细胞裂解液1 ml(0.1%Triton X-100)，4℃作用20 min，收集裂解液测定 ALP浓度，以pNPP为底物，据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。37℃、pH10.0条件下，每分钟转化产生1 μmol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位。BCA法检测细胞总蛋白进行蛋白浓度校正，ALP活性以U/μg蛋白表示。阻断ER信号组将细胞先用含有1 μmol/L ICI182780 的培养液预处理 2 h〔5〕，然后和药物共培养;阻断p38信号先用含有20 μmol/L SB203580的培养液预处理 2 h〔6〕，然后和药物共培养。

1.2.5 ELISA法检测细胞Col I和BGP 细胞消化后以5×104个/ml的密度每孔3 ml接种到6孔板中，含10%碳吸附的FBS的αMEM培养3 d，细胞同步化后更换为各组含药培养液或对照液，培养72 h，吸弃孔中的培养液，每孔加含PMSF的细胞裂解液750 μl，冰上裂解20 min。收集裂解液，ELISA法测BGP和ColⅠ，包括标准曲线的绘制，加样，温育，洗涤，加底物，温育，加终止液，酶标仪测OD值，根据标准曲线计算含量，具体步骤按说明书进行。BCA法检测细胞总蛋白进行蛋白浓度校正。阻断ER信号组将细胞先用含有1 μmol/L ICI182780的培养液预处理2h，然后和药物共培养;阻断p38信号先用含有20 μmol/L SB203580的培养液预处理2h，然后和药物共培养。

1.2.6 茜素红染色计数细胞矿化 细胞消化后以5×104个/ml的密度每孔3 ml接种到6孔板中，含10%碳吸附的FBS的无酚红αMEM培养3 d，细胞同步化后更换为各组含药培养液或对照液，培养14 d后，吸去培养液，95%乙醇固定20 min，吸去固定液，加入0.1%的茜素红染色液，30 min，祛除染色液;在低倍镜视野(4×10)下进行矿化结节计数，每孔细胞随机计数6个视野的矿化结节数。

1.2.7 Western印迹检测p38MAPK的表达 细胞消化后以2×107个/瓶接种于25 cm2的培养瓶内，细胞同步化后分组，不同条件干预24 h后，细胞裂解，Western印迹检测p38MAPK和磷酸化的p38MAPK蛋白的表达。

2 结果

2.1 ICA对 MC3T3-E1 Subclone14细胞活力的影响 10-7、10-6、10-5mol/L的ICA在细胞培养48 h和72 h后，和对照组比较，统计学无显著性差异(P＞0.05)，见表1。

2.2 ICA对MC3T3-E1 Subclone14细胞分化和矿化的影响和对照组比较，10-7、10-6、10-5mol/L 的 ICA 组 ALP、ColⅠ活性均明显升高(P＜0.01或P＜0.05);10-6、10-5mol/L的ICA组BGP较对照组明显升高(P＜0.01);ICA各组细胞形成矿化结节的数量较对照组均明显升高(P＜0.01)，见表2，图1。

2.3 阻断ER信号对MC3T3-E1Subclone14细胞分化的影响ER阻断剂 ICI182780共同处理后，10-5mol/L的 ICA促进MC3T3-E1 Subclone14细胞表达 ALP、Col I、BGP 明显减少，和单纯应用ICA组有明显差异(P＜0.01)，见表3。

2.4 ICA对MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白磷酸化的影响不同浓度的ICA培养24 h后，Western印迹检测结果相对分析表明，ICA可以剂量依赖性的提高p38MAPK蛋白磷酸化的表达量，10-7，10-6，10-5mol/L ICA 组蛋白相对表达量分别为0.050±0.013，0.067 ±0.020，0.096 ±0.019，经单因素方差分析，各剂量组和对照组(0.030±0.016)以及各剂量组之间在统计学上均有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)，见图2。

表1 ICA对MC3T3-E1 Subclone14细胞活力的影响(s)

表1 ICA对MC3T3-E1 Subclone14细胞活力的影响(s)

48 h 72 h组别 n

表2 ICA对MC3T3-E1 Subclone14细胞分化和矿化的比较( s，n=6)

表2 ICA对MC3T3-E1 Subclone14细胞分化和矿化的比较( s，n=6)

与对照组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

组别 ALP(U/mg)Col I(ng/mg)BGP(pg/mg)矿化结节数(n)27 10-7mol/L ICA 18.04±1.491)68 58±14.522) 14.34±2.68 53.50±3.732)10-6mol/L ICA 20.65±1.522)85.76±14.332)17.25±1.622)62.00±4.002)10-5mol/L ICA 53.91±6.082)102.82±11.732)20.29±2.162)72.33±4.632)对照组 15.49±1.75 46.13±10.48 11.98±1.47 43.33±4.

表3 阻断ER信号对MC3T3-E1Subclone14细胞分化活性的比较( s，n=6)

表3 阻断ER信号对MC3T3-E1Subclone14细胞分化活性的比较( s，n=6)

与对照组比较：1)P＜0.01;与ICA组比较：2)P＜0.01，下表同

组别 ALP(U/mg)Col I(ng/mg)BGP(pg/mg)15.64±1.73 40.92±8.80 12.18±0.85 ICI182780组 15.91±1.51 39.03±9.59 11.97±1.08 ICA组 34.29±3.311) 88.43±10.591) 19.20±1.581)ICA+ICI182780组16.17±2.622) 48.87±9.662) 12.96±0.512)对照组

2.5 阻断p38MAPK信号对MC3T3-E1Subclone14细胞分化的影响 与 p38MAPK阻断剂 SB203580(20 μmol/L)共同处理后，10-5mol/L的 ICA促进 MC3T3-E1Subclone14细胞表达ALP、Col I、BGP明显减少，和单纯应用ICA组有明显差异(P＜0.01)。见表4。

2.6 p38MAPK活化和ER的关系 加入ER阻断剂ICI182780后ICA促p38MAPK磷酸化明显减弱，和10-5mol/L ICA组比较在统计学上有明显差异(0.036±0.011 vs 0.084±0.012，P＜0.01)，单纯加入ICI182780组磷酸化和对照组无明显差异(0.032±0.013 vs 0.029±0.012，P ＞0.05)，因此可以推定p38MAPK信号可能在ER信号的下游，见图3。

表4 阻断p38信号对MC3T3-E1Subclone14细胞分化活性的比较( s，n=6)

表4 阻断p38信号对MC3T3-E1Subclone14细胞分化活性的比较( s，n=6)

组别 ALP(U/mg)Col I(ng/mg)BGP(pg/mg)15.96±1.23 47.48±8.07 12.40±1.19 SB203580组 15.37±1.17 47.94±9.19 12.00±1.78 ICA组 35.05±2.271) 88.98±7.781) 20.16±2.151)ICA+SB203580组 16.06±2.062) 51.33±7.562) 13.09±1.052)对照组

图1 细胞培养14 d，各组的矿化结节图

图2 ICA对MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白相对表达量的影响

图3 阻断ER信号后p38MAPK活化的情况

3 讨论

既往研究已经显示ICA可以影响成骨细胞活性，但具体作用靶点尚不清楚。MC3T3-E1 Subclone 14是从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一个亚克隆，和原代培养颅顶OB的行为类似，是研究体外OB分化的较好模型。我们通过研究发现在一定的浓度范围内(10-7、10-6、10-5mol/L)ICA不影响MC3T3-E1 Subclone 14细胞的增殖，但在促分化的试验中我们发现ICA可以浓度依赖性的促进细胞ALP、Col I、BGP的表达，促进矿化结节的形成，这和陈克明等〔8〕的研究具有相似之处，它们发现ICA无促进细胞增殖活性，10-5mol/L及更高浓度可抑制骨髓间质干细胞增殖，但10-5mol/L的ICA促进原代培养的骨髓间质干细胞的成骨性分化。

许多补肾中药都有类性激素样作用，因此被作为植物雌激素，主要分为异黄酮类、香豆雌酚、木质素类〔9〕。淫羊藿苷属黄酮类的化合物，因此在进一步的作用机制研究中我们首先选择了雌激素受体信号。雌激素受体信号是成骨细胞分化过程中的一个重要信号，雌激素通过雌激素受体参与骨骼生理和病理的相关过程，对骨的生长发育、成熟以及骨量维持有重要意义。最初认为雌激素的功能只受核雌激素受体ERα和ERβ的调控，随着研究的深入，诸多证据表明存在与质膜结合的ER，并通过激活信号通路调控基因表达〔10〕。ICI182780是一种甾体类选择性雌激素受体调节剂，是ER的特异性拮抗剂，通过加速ER降解而下调ER、影响ER二聚体化、干扰ER细胞核定位以及减少ER与ERE的结合。ERα和ERβ都同样对特异性拮抗剂ICI182780反应，ICI182780基本可以完全阻断雌激素的效应。对于ICI182780的用量一般文献认为终浓度为1 μmol/L时即可完全阻断雌激素的效应，因此我们在实验中也采用了终浓度为1 μmol/L的实验浓度。实验通过用ICI182780阻断ER后发现，ICA促进MC3T3-E1细胞分化作用明显下降，可见ER中介了ICA的促分化的作用，这也和其他一些异黄酮类化合物的作用类似〔5〕。

MAPK通路主要包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK，又称SAPK)、p38和ERK5通路等，是胞内信号转导的重要成员，参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生理过程〔11〕，是多种因素激发胞内信号的会聚点。Suzuki等研究发现在OB的分化过程中，p38对细胞分化起着重要作用，但对增殖的作用不明显，ERK途径对细胞的增殖起重要作用，对其分化作用不明显〔12〕。p38MAPK可以介导一些激素和生长因子刺激OB分化的作用，如甲状旁腺激素〔13〕、脂联素等〔14〕。已发现的可以影响骨代谢的一些中药活性成分均可通过p38MAPK信号来影响 OB 分化，如香豆素〔6〕、金雀异黄酮〔15〕、蛇床子素〔16〕等。因此我们推测ICA也可通过p38MAPK信号影响OB分化。我们研究发现，ICA(10-7、10-6、10-5mol/L)可以剂量依赖性的提高p38MAPK蛋白磷酸化的表达量;应用特异性阻断剂SB203580处理后，可以显著降低 ICA促进 MC3T3-E1 Subclone14细胞表达ALP、Col I、BGP的作用。进一步研究发现，雌激素受体阻断剂ICI182780可以降低ICA促细胞p38MAPK的磷酸化的作用，说明p38MAPK信号在雌激素受体信号的下游。因此我们认为ICA促MC3T3-E1 Subclone14细胞分化的作用主要是通过ER受体信号和p38MAPK信号来实现的。

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