黄芪多糖对炎症性肠病模型大鼠NFATC4 表达的影响

杨 敏 林焕冰 张金桃 曾永梅 陈佩瑜 耿岚岚 龚四堂

炎症性肠病(IBD)是指原因不明的一组非特异性慢性复发性胃肠道炎症性疾病。目前应用于临床的生物制剂如抗-TNF 抗体(Infliximab、Adalimumab)及抗黏附分子抗体(Tysabri)，虽然治疗IBD 疗效肯定，但其价格昂贵，且有诱发肿瘤和感染可能。因此，开发有效、低毒及低成本的IBD治疗药物，备受研究者们的关注。中医益气健脾方剂有增强胃肠黏膜屏障功能、促进黏膜防护因子表达等作用。组方中主要成分黄芪，其主要有效成分黄芪多糖(APS)可诱导多种细胞分化。本研究组前期利用人类全基因组表达谱基因芯片亦证实APS 可调控K562 细胞的增殖分化［1］;筛选出高表达的转录因子NFATC4，在APS 调控细胞增殖分化中发挥重要作用，可能是参与APS 调控K562 细胞增殖分化的重要转录因子。本研究以三硝基苯磺酸(TNBS)诱导IBD 大鼠模型，观察APS 对模型大鼠受损肠黏膜的修复作用，NFATC4 在结肠组织的表达，验证NFATC4 在APS 治疗IBD 中的分子靶点作用，探讨APS 维持及修复上皮屏障功能的作用机制，为临床治疗IBD 提供新的选择。

1 方法

1.1 实验动物SD 大鼠 SPF 级，体重(200 ±20)g，雄性，无菌环境饲养。南方医科大学实验动物中心提供。

1.2 IBD 大鼠模型的建立 采用TNBS 诱导法，简述如下:取成年健康雄性SD 大鼠，造模前禁食24 h，自由饮水，10%水合氯醛(300 mg·kg－1)麻醉后用直径2.0 mm、长约12 cm 的硅胶管从肛门轻缓插入，深约8 cm，将150 mg·kg－1TNBS(3 mL·kg－1，即配成50 mg·mL－1)的50%乙醇溶液缓慢推入结肠，诱导IBD 形成。为确保注入的TNBS 能够在大肠内弥散分布，注入后将大鼠尾巴提起，持续倒置1 min。灌肠后24 h 大鼠出现懒动、厌食、腹泻和黏液血便。

1.3 试剂 注射用APS(天津赛诺制药有限公司，批号110502);NFATC4 ELISA 试剂盒(ADL 公司，美国)。

1.4 分组 将45 只大鼠随机分为5 组，每组各9 只:假手术组(建模时仅给予50%乙醇溶液)、IBD 模型组(不予APS 干预)、APS 低剂量组(100 mg·kg－1)、APS 高剂量组(200 mg·kg－1)和地塞米松对照组(地塞米松0.3 mg·kg－1，0.333 mg·mL－1)。建立IBD 模型后48 h 各组予腹腔注射相应药物，每日1 次，给药7 d。

1.5 样品制备 乙醚麻醉下处死大鼠，截取自肛门向上8 cm 结肠，沿系膜纵行剪开，冰PBS 冲洗干净，肉眼评估结肠黏膜损伤程度。在新鲜结肠标本上沿肠系膜缘及对侧纵向取长约1.5 cm、宽0.3 cm 肠壁组织2 块。苏木精-伊红染色，光镜下判断黏膜损伤，进行损伤病理学分度。取病理学标本后剩余结肠组织即刻放入冻存管置于液氮中保存。

1.6 结肠黏膜形态学评分方法 本文第一作者依据文献［2］的方法进行评分，为5 级评分(0 ～4 分)，其中0 分为黏膜无损伤，4 分为黏膜损伤程度最重。

1.7 结肠黏膜损伤病理学分度 由广州市妇女儿童医疗中心病理科专人依据文献［3］的方法进行病理学分度，包括急性炎症细胞浸润、慢性炎症细胞浸润、丝素蛋白沉积、黏膜下层水肿、上皮细胞坏死和上皮组织溃疡6 项，每项为2 级或3 级评分。

1.8 ELISA 测定结肠组织NFATC4 蛋白含量 按ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.9 实时PCR 法检测结肠组织NFATC4 mRNA 表达 结肠组织提取总RNA 和合成cDNA，采用实时PCR 法检测NFATC4 mRNA 表达，以β-actin 为内参，引物见表1。目的基因的Ct 值与β-actin 的Ct 值的差值△Ct，以2－△Ct 作为相对含量进行分析。实时定量PCR 法扩增曲线图和熔解曲线见图1。

表1 引物序列、循环条件、实时PCR 基因扩增长度Tab 1 Sequences of primer，conditions of PCR and the length of product with real time PCR

1.10 统计学方法采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，计量资料以±s表示，方差齐性多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSK 法;方差不齐时采用秩和检验。计数资料比较采用χ2检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APS 对大鼠结肠形态学评分的影响 大鼠结肠组织形态学肉眼评分为:假手术组0 分、IBD 模型组(5.67 ±0.87)分、APS 低剂量组(3.56 ±0.89)分、APS 高剂量组(1.56 ±0.53)分、地塞米松对照组(0.89 ± 0.78)分，组间差异总体上有统计学意义(F=69.195 ，P=0.000)。与假手术组比较，IBD 模型组形态学评分显著增高(P ＜0.001);与IBD 模型组比较，APS 高剂量组、APS 低剂量组与地塞米松对照组形态学评分显著降低(P 均＜0.001)。

图1 实时定量PCR 法检测结肠组织NFATC4 mRNA 扩增曲线图和熔解曲线图Fig 1 Diagrams of amplication cure and melting cure with real time PCR

2.2 APS 对结肠黏膜病理损伤的影响 病理学评分:假手术组(0.11 ± 0.08)分、IBD 模型组(5.67 ±1.15)分、APS低剂量组(3.33 ±0.58)、APS 高剂量组(1.33 ±1.15)分、地塞米松对照组(1.67 ±1.52)分，组间差异总体上有统计学意义(F =13.34，P =0.001)。与假手术组比较，IBD 模型组病理学评分显著提高(P ＜0.001);与IBD 模型组比较，APS 高剂量组、APS 低剂量组与地塞米松对照组病理学评分显著降低(P 均＜0.001)。组织病理学检查显示，假手术组可见正常的黏膜结构(图2A);IBD 模型组可见溃疡，组织明显水肿，出血，大量的炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主(图2B);APS 低剂量组溃疡少见，组织轻度水肿，炎性细胞浸润(图2C);APS 高剂量组及地塞米松对照组见愈合的溃疡组织，组织水肿及出血明显减轻，炎性细胞明显减少(图2D 和E)。

图2 各组大鼠光镜下结肠黏膜所见(苏木精-伊红染色，×200)Fig 2 The colonic mucosal pathological pictures under the light microscope(HE stain，×200)

2.3 APS 对结肠组织NFATC4 表达的影响 如图3A 所示，各组间结肠黏膜NFATC4 mRNA 的表达差异总体上有统计学意义(F =9.7，P =0.000)。与假手术组比较，IBD模型组NFATC4 mRNA 表达显著增加(P =0.002);与IBD模型组比较，APS 高剂量组、APS 低剂量组与地塞米松对照组NFATC4 mRNA 表达显著增加(P 均＜0.001)。

2.4 APS 对结肠组织NFATC4 蛋白表达的影响 如图3B所示，各组间结肠黏膜NFATC4 蛋白的表达差异总体上有统计学意义(F=21.87，P=0.000)。与假手术组比较，IBD模型组NFATC4 蛋白表达无显著变化(P =0.203);与IBD模型组比较，APS 高剂量组与地塞米松对照组NFATC4 蛋白表达显著增加(P 均＜0.001)。

图3 APS 对结肠组织NFATC4 mRNA 和蛋白表达的影响Fig 3 The effect of APS on NFATC4 mRNA and protein expression in colon

3 讨论

IBD 的发病机制可能与黏膜免疫系统激活、肠上皮黏膜屏障、炎性细胞因子产生及遗传易感性相关。肠上皮屏障损伤与修复贯穿于IBD 的整个过程，是IBD 发病机制中的中心环节［4］。因此，观察肠黏膜的损伤、修复以及肠上皮细胞的增殖与分化，对研究肠上皮屏障功能及IBD 的治疗有重要意义。TNBS 诱导的IBD 动物模型，其结肠组织学改变的许多特点与人类IBD 相似。该模型持续时间较长，慢性炎症表现突出，体现急性炎症向慢性转化的动态过程，简单易行，易于复制，为研究炎症慢性化、探索药物治疗创造了条件。

黄芪中的有效成分APS 不仅对机体有显著的免疫调节作用，还可诱导多种细胞增殖分化［5］、调控细胞周期与细胞凋亡。本研究从肉眼形态学发现，与IBD 模型组比较，APS 高剂量组、APS 低剂量组与地塞米松对照组结肠形态学评分显著降低，主要表现有上皮组织糜烂及溃疡减少，组织水肿减轻。病理学分析发现，与IBD 模型组比较，APS 高剂量组、APS 低剂量组与地塞米松对照组的病理学评分显著降低，主要表现为浸润的急慢性炎症细胞、坏死的上皮细胞及上皮组织形成溃疡减少。因此，APS 有减少IBD 模型大鼠结肠组织的炎性细胞浸润，修复受损的结肠黏膜，并促进溃疡愈合作用。

NFATs 是严格控制适应性免疫T 细胞和B 细胞对促炎细胞因子表达的至关重要的转录因子，参与T 细胞、B 细胞激活，趋化因子和细胞因子介导的炎症反应，调控细胞增殖及凋亡。随着对NFATs 认识的增多，发现其不仅表达于免疫系统，亦在食道和小肠上皮、心血管、脑、肺和脂肪等多种组织表达，可调控多种细胞的增殖与分化［6，7］。本课题组前期研究证实NFATC4 在K562 细胞中表达;基因表达谱分析发现，APS 诱导后的NFATC4 表达倍数显著增高，推测NFATC4 可能是APS 诱导K562 细胞增殖分化的重要的转录因子。本研究发现:①正常结肠组织可表达NFATC4;②IBD 模型组结肠组织NFATC4 mRNA 表达较假手术组增高，推测可能的原因是IBD 慢性炎症启动了机体对抗损伤黏膜的修复机制，NFATC4 mRNA 表达增加，促进肠上皮细胞的增殖与分化;③APS 干预后，APS 低剂量组与APS 高剂量组的NFATC4 mRNA 表达均比IBD 模型组显著增高，表明APS 可诱导IBD 结肠组织NFATC4 mRNA 高表达，推测NFATC4 可能参与结肠上皮细胞的增殖分化的调控，以修复受损的肠屏障功能。在蛋白水平上，仅APS 高剂量组NFATC4 蛋白表达增加。NFATC4 对APS 调控结肠上皮细胞增殖分化是否存在剂量依赖性，有待进一步研究。

多味中药组成的方剂是一个包含多种复杂化学成分的群体，通过多系统、多靶点和多层次作用于人体发挥其治疗作用，往往不能被一个或几个模型和指标所反映，导致难以进行药物作用机制的深入研究。而单味中药及其有效成分的研究是方剂研究和深入进行有效成分分离提取的前提，也是新药研制必不可少的重要依据。本研究结果提示NFATC4 可能在APS 治疗IBD 中起到分子靶点的作用，但APS 对IBD 维持和修复肠黏膜上皮的屏障功能、NFATC4表达调控、肠上皮细胞增殖与分化三者之间的相互作用机制尚不明确，有待进一步的研究。

［1］Yang M(杨敏)，Zhao DH，Qian XH. Effects of the main extracts of Astragalus membranaceus on inducing the erythroid differentiation of K562 cells. Med J Chin PLA(解放军医学杂志)，2008，33(3):305-308

［2］Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.Gastroenterology，1989，96(3):795-803

［3］Millar AD，Rampton DS，Chander CL，et al. Evaluating the antioxidant potential of new treatments for inflammatory bowel disease using a rat model of colitis.Gut，1996，39(3):407-415

［4］Cromer WE，Mathis JM，Granger DN，et al. Role of the endothelium in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol，2011，17(5):578-593

［5］Yang M，Qian XH，Zhao DH，et al. Effects of Astragalus polysaccharides to the erythroid lineage and microarray analysis in K562 cells. J Ethnopharmacol，2010，127(2):242-250

［6］Vihma H，Pruunsild P，Timmusk T. Alternative splicing and expression of human and mouse NFAT genes. Genomics，2008，92(5):279-291

［7］Wang Q，Zhou Y，Jackson LN，et al. Nuclear factor of activated T cells (NFAT)signaling regulates PTEN expression and intestinal cell differentiation. Mol Biol Cell，2011，22(3):412-420