银花泌炎灵片对大肠埃希菌的抑菌机制

胡 亚，王冀邯，张晓天，王槐栋，赵春燕，王 放

（吉林大学白求恩医学院，吉林 长春 130021）

银花泌炎灵片对大肠埃希菌的抑菌机制

胡 亚，王冀邯，张晓天，王槐栋，赵春燕，王 放*

（吉林大学白求恩医学院，吉林 长春 130021）

目的 检测银花泌炎灵片95%乙醇提取物对大肠埃希菌的体外抑菌活性；并通过绘制时间-杀菌曲线（KCs）探讨其抑菌机理。方法 采用琼脂稀释法进行大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922和20株泌尿系统感染者临床分离株的体外抑菌活性研究，测定最小抑菌浓度（MIC）并绘制KCs。结果 银花泌炎灵片95%乙醇提取物对大肠埃希菌标准菌株和临床分离株都具有抑菌活性，MIC50-90均为50～100mg/mL；从绘制出的KCs可以看出：与对照组相比，银花泌炎灵片95%乙醇提取物可以使细菌对数生长期延迟出现，并缩短细菌平台期。结论 银花泌炎灵片95%乙醇提取物对大肠埃希菌具有一定的抑菌活性，其初步抑菌机理可能与其延长细菌的分裂周期，抑制细菌的生长繁殖有关。

银花泌炎灵片；大肠埃希菌；抑菌活性；最小抑菌浓度；抑菌机理

泌尿系统感染是临床常见、多发的感染性疾病，病程顽固迁延，具有治疗时间长、复发率高等特点。近年来随着抗生素的广泛应用，导致了临床耐药菌株的增加，使抗生素效率大大降低。因此，寻求治疗泌尿系统感染的抗生素替代药物迫在眉睫。我国中医药历史悠久，研究发现，传统中药有清热解毒、抗菌等作用[1-2]，具有相对安全、不良反应小、价格低廉、不易产生耐药性等优点，在抗感染治疗临床应用中存在巨大的开发潜力[3]。

银花泌炎灵片是由金银花、半枝莲、扁蓄、瞿麦、石韦、川木通、车前子、淡竹叶、桑寄生、灯心草等组成的纯中药制剂，具有清热解毒，利湿通淋的功效。临床常用于治疗急性肾盂肾炎，急性膀胱炎，下焦湿热证等泌尿系统感染，是目前临床治疗难治性泌尿系统感染的常用药。然而，却未见有关银花泌炎灵片抑菌机制的研究。本研究通过KCs法探讨“银花泌炎灵片”对泌尿系统感染主要致病菌大肠埃希菌的初步抑菌机理，为其临床应用和推广提供更坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

标准菌株：大肠埃希菌ATCC 25922，保存于吉林大学病原生物学教研室；20株大肠埃希菌临床分离株：吉林大学第一医院泌尿系统感染患者标本中分离，经本实验室鉴定保存。

1.2 药品

试验药物：银花泌炎灵片95%乙醇提取物, 由吉林大学药学院新药研究室提供；对照药物：双黄连胶囊（河北奥星集团药业有限公司，国药准字Z10980155，产品批号100520）。

1.3 主要试剂和仪器

M-H肉汤培养基（青岛高科技园海博生物技术有限公司；产品批号20100517）；营养琼脂培养基（北京双旋微生物培养基制品厂，产品批号20111202）；生物安全柜（AIRTECH BHC-1300ⅡA/B）、紫外分光光度计（UNIC UV-2800AH）、电热恒温培养箱（DPX-9162B-1）。

1.4 药物敏感性试验

1.4.1 菌液制备 取出复苏好的菌种，挑选1～2个典型的菌落接种于20 mL M-H肉汤培养基内，37℃恒温振摇3～4 h，此时生长浊度约为9×108cfu / mL，用M-H肉汤培养基稀释为0.5麦氏浊度标准浓度的菌液备用。

1.4.2 琼脂稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）[4]配制药物-营养琼脂平板培养基，使药物的终浓度分别为200、100、50、25、12.5mg / mL。取100 uL 0.5麦氏浊度标准浓度的稀释菌液涂布于平板表面，37℃培养18 h后，记录MIC。

1.5 绘制时间-杀菌曲线（KCs）[5]

取无菌试管3支，每管加10 mL MH肉汤。第1管加入终浓度为100mg/mL银花泌炎灵片95%乙醇提取物，第2管加入终浓度为100mg/mL双黄连胶囊，第3管作为阴性对照。在各管中分别加入0.1 mL浓度为0.5麦氏浊度标准的待测菌液，使其终浓度为106cfu/mL 37℃恒温培养箱内培养16 h，每2 h从各管取样0.1 mL，加入到含有0.9 mL 0.9%的生理盐水的试管中，编号为1，从中取出0.1 mL加入到另一含有0.9 mL生理盐水的试管中，编号为2，以此类推，稀释至第10管，其浓度依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10cfu / mL，分别从每只试管中取出0.1 mL菌液，均匀涂布于已灭菌的营养琼脂平板上，每个浓度2个平板，于37 ℃恒温培养箱内培养16～18 h，用肉眼进行菌落计数，只计数菌落数在30～300个的平板，取其平均数，根据稀释浓度计算原菌液的浓度。

2 结果

2.1 体外抑菌活性

银花泌炎灵片95%乙醇提取物的MIC50-90为50～100mg/mL，阳性对照药物双黄连胶囊的MIC50-9050～100mg/mL。“银花泌炎灵片”95%乙醇提取物对大肠埃希菌具有一定的抑菌活性，和阳性对照药物双黄连胶囊抑菌效果相当。结果见表1。

表1 银花泌炎灵片对大肠埃希菌体外抑菌结果

2.2 时间-杀菌曲线（KCs）结果

经Orange 7.5软件画图，时间-杀菌曲线（KCs）结果见图1。由图可见：与对照组相比，各实验组均从0 h开始对大肠埃希菌ATCC 25922生长发挥抑制作用，大肠埃希菌的生长明显受到抑制，菌体的生长处于较低的水平；对数期较正常菌延迟4 h左右出现，平台期缩短，直接进入衰退期。临床株的时间-杀菌曲线（KCs）与ATCC 25922曲线图形相似。

图1 大肠埃希菌ATCC 25922时间-杀菌曲线（KCs）

3 讨论

目前对于中药抑菌机理方面的研究报道较少，有学者认为抑菌中药的可能抑菌机理为破坏细菌的新陈代谢，改变细菌细胞的通透性，氧化细菌体内的活性基团，破坏菌体蛋白或酶蛋白等[6]。但由于抑菌中药多是复方制剂，抑菌活性可能是中药中的多种单体成分通过多个抑菌途径共同起作用的结果。因此，抑菌中药对细菌分裂周期的影响至关重要。本研究旨在研究临床常用抑菌中药“银花泌炎灵片”体外抑菌活性的基础上，以KCs法绘制抑菌曲线，分析药物对细菌分裂周期的影响，以初步揭示“银花泌炎灵片”的抑菌机理。

本研究结果表明银花泌炎灵片95%乙醇提取物对大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922和20株泌尿系统感染患者大肠埃希菌临床分离株都具有一定的抑菌活性。KCs研究发现银花泌炎灵片95%乙醇提取物延迟了大肠埃希菌的分裂时间，使大肠埃希菌生长周期中的对数生长期延长，并加速进入衰退期，从而抑制了细菌的生长繁殖。由于该药为中药复方制剂，药物中的单体化学成分众多，具体是哪一种成分或几种成分的联合抑菌作用，还有待于进一步研究。

[1]Almeida AA,Farah A,Silva DA,et al.Antibacterial activity of coffee extracts and selected coffee chemical compounds against enterobacteria[J].J Agric Food Chem,2006,54(23):8738.

[2]田应彪,陈泽慧,杨名慧,等.16 种中药水煎液对MRSA 和MSSA 体外抑菌试验观察[J].中国医院药学杂志,2009,29 (11):897-899.

[3]陈泽慧,田应彪,李丹丹,等.五味子,石榴皮等中药对鲍曼不动杆菌体外的抑菌作用[J].中国医院药学杂志,2011,31(15):1248-1251.

[4]Jyh-Ferng Yang,Cheng-Hong Yang,Hsueh-Wei Chang.Chemical Composition and Antibacterial Activities of Illicium verum Against Antibiotic-Resistant Pathogens[J].Journal of medicinal food,2010,13(5):1254-1262.

[5]Guoxing Liu,Jun-Chao Liang,Xue-Lin Wang.In Vitro Synergy of Biochanin A and Ciprofloxacin against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus[J].molecules,2011(16):6656-6666.

[6]李 娟,李晓东,杨丽霞,等.单味中药体外抑菌活性的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(11):283-286.

Preliminary study of antibacterial mechanism of Yinhua Miyan Ling Tablet on Escherichia coli by KCs method

HU Ya, WANG Ji-han, ZHANG Xiao-tian, WANG Huai-dong, ZHAO Chun-yan, WANG Fang＊
(Norman Bethune College Medicine Jilin University,Changchun,Jilin 130021,China)

Yinhua Miyan Ling Tablet;E. coli; Antibacterial activity;Minimum inhibitory concentration;Antibacterial mechanism

R285

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.08.001.003.02

2012－03－02

胡 亚（1985－），女，硕士研究生，主要从事药理学研究。

*王 放，男，副教授，吉林大学白求恩医学院。

(本文编辑: 李新刚)