经脑间质微穿刺注射胞磷胆碱治疗脑缺血的有效剂量范围研究*

陈 翯 韩 鸿宾 傅 瑜 马长城 彭 芸 岳云龙 张学梅

（北京大学第三医院放射科 磁 共振成像设备与技术北京市重点实验室，北京 100191）

为避开血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）对药物的阻挡作用，使药物和靶细胞有效接触，减小药物剂量，避免常规给药途径造成的毒副作用，学者们从20世纪末开始尝试经脑间质微穿刺给药，其中最成熟的例子就是对流增强给药方式（convection enhanced delivery，CED）应用于治疗恶性胶质瘤［1］。但自其发明至今已有16年的历史，其发展缓慢主要是由于给药过程缺乏有效的监测手段，并且由于CED采用加压给药的方式，有潜在导致脑间质水肿等并发症的可能。最近本课题组利用小分子药物在脑间质内扩散的规律，建立了微穿刺经脑间质简单扩散给药（simple diffusion delivery，SDD）的方式。尽管已证实经脑间质途径给予5μl浓度为50 mmol/L 的胞磷胆碱（cytidine 5’-diphosphocholine，CDPC）可有效保护梗死区域［2］，但药物发挥作用的有效剂量范围及作用机制都尚不清楚。为解决上述问题，本研究拟对50 mmol/L周围的浓度进行试验来进一步明确经脑间质途径应用微量CDPC治疗脑缺血的有效剂量范围，为经脑间质途径的微创给药治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

56只普通级成年雄性SD大鼠购自北京大学医学部实验动物科学部［SYXK（京）2011－0039］，体重260～320 g。动物实验设计经北京大学医学部伦理委员会审批通过（LA2009－008）。

1.2 分组

56只雄性SD大鼠随机分成7组，各8只：对照组，尾状核中心注射生理盐水5μl；腹腔组，腹腔注射 CDPC 2 g/kg［3］；实验组1～5，尾状核中心注射CDPC 5μl，浓度分别为25、40、50、60和75mmol/L。7组均于注射后2 h行永久性大脑中动脉栓塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型。

1.3 经脑间质途径给药

实验组1～5：CDPC注射液（山东齐鲁药业）用生理盐水稀释至用药浓度后备用。大鼠经复合麻醉剂（3 ml/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪。切开头皮，分离骨膜，暴露前囟，使用微量注射器将5μl不同浓度的CDPC溶液以0.2 μl/min的速度均匀手推注入大鼠脑内尾状核区（前囟前1 mm，旁开3 mm，深4.5 mm）。注射完毕后留针5 min，再缓慢移出针头。对照组注射方法相同，注射药物改为生理盐水5μl。腹腔组为腹腔注射CDPC 2 g/kg。

1.4 pMCAO 模型制作［4］

注射CDPC或生理盐水后2 h，复合麻醉剂（3 m l/kg）腹腔麻醉后取仰卧位固定。润滑液润湿后备皮，做颈部前正中切口。沿气管一侧向下钝性分离肌肉筋膜组织，保持术野清晰干净，两侧皮肤与皮下组织用小拉钩固定于手术台，剪断二腹肌，用电凝器分离下端筋膜，分离暴露右侧颈总动脉。向上于颌下腺下方找到颈总动脉分叉，距分叉下1 cm处用微动脉夹夹闭颈总动脉，双线结扎颈外动脉，距根部约0.5 cm，两线间保证一定距离，剪断。用电凝器夹闭颈外动脉小分支，查看颈内动脉各分支，辨认翼腭动脉，夹闭颈内动脉主干。在颈外动脉上剪一小口，将线栓经小口插入颈外动脉，松开经内动脉处的动脉夹，将栓子送入颈内动脉，插入深度（距颈总动脉分叉处）约为18～22 mm，有抵抗感时停止。栓子送入后，用手术缝线固定线拴，松开颈总动脉处的动脉夹，清理手术视野后，缝合颈部皮肤。术中用电热毯使大鼠保持恒定体温，术野覆盖湿纱布。

1.5 梗死灶体积定量［5］

pMCAO术后12 h断头取脑。在－20℃条件下对新鲜鼠脑进行速冻以增加硬度，将鼠脑置于脑切片模具中，沿视交叉向后切片，每片厚约2 mm。将脑片置于0.2％的2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyl－tetrazolium chloride，TTC）染色液中，在37℃温箱中染色15～30 min（染色期间不断翻动使染色均匀）。染色后的脑片经4％多聚甲醛固定并摄片。用Image－Pro－Plus 6.0软件测量梗死灶的体积百分比，计算公式如下：

1.6 统计学分析

2 结果

见图1，梗死灶体积百分比在pMCAO大鼠模型不同处理组间差异显著（F=11.164，P=0.000）。实验组2、3和4三组大鼠的平均梗死体积百分比明显小于对照组（P均=0.000）。虽然实验组1、5和腹腔组大鼠的平均梗死体积百分比与对照组相比有下降趋势，差异无显著性（P分别为0.419，0.965，0.423）。故认为经脑间质途径应用CDPC治疗脑梗死的有效浓度范围是40～60 mmol/L。

3 讨论

本研究证实，经脑间质途径应用SDD微穿刺给予微剂量CDPC可成功避开BBB的阻挡，有效预防缺血性脑损伤，其有效浓度范围是40～60 mmol/L，仅为常规腹腔给药剂量的1/800，而神经保护效率却极大提升，达到了微创治疗的目的。尽管目前无法在脑缺血发生前对人体实施经脑间质途径的预防性给药，但是对于冠状动脉旁路移植术后卒中的预防［6］，或许这是一个潜在有效的替代措施。

脑间质自20世纪60年代发现以来，被认为是神经细胞与血液之间最重要的物质交换通道之一。正常脑组织中间质的平均容积分数超过20％［7］，远远高于脑微血管占全脑容积的比例（＜3％），为药物在脑内的扩散与分布提供了解剖结构基础。经脑间质给药治疗最早由Bobo等于1994年提出，其核心理念为CED，即通过施加一个正向液压梯度向脑内持续注射药物，该方法被认为是未来治疗神经系统疾病的有效途径［8］。CED的优势在于大分子药物在脑间质内扩散受限，应用持续加压给药可以使药物到达靶区。由于CED采用持续加压给药，因此容易引起脑水肿等并发症，有效性及稳定性仍待提高［9］。然而，对于小分子物质，如 CDPC，可以不借助任何外加压力，只依赖局部浓度梯度所致的自由扩散运动就可到达靶区，这就使得非外加压力性的微创、微剂量给药（SDD）成为可能，并可有效避免CED因持续加压注射引起的脑水肿等并发症。

图1 pMCAO大鼠模型不同处理组梗死灶的TTC染色结果（白色为梗死区，梗死体积百分比：对照组，27.7％±10.5％；腹腔组，24.0％±10.4％；实验组1，27.5％±11.9％；实验组 2，8.1％±4.1％；实验组3，4.1％±2.0％；实验组4，8.7％±2.4％；实验组5，24.0％±12.9％）

决定CDPC神经保护效率的关键因素是到达靶组织的药物局部浓度。根据扩散方程，脑ECS中的药物浓度不仅依赖于扩散，还依赖于清除。既往关于脑脊液（cerebro-spinal fluid，CSF）脑内引流的研究表明，实验所用放射性示踪剂可在尾状核内长时间贮留，2 h后仅有10％～15％的示踪剂进入CSF团流［10］，这一结论为本研究结果提供了佐证。而CDPC对侧脑室旁组织和丘脑区的“乏保护”，则是清除速率过快的结果，推测与该区域BBB结构不完整有关［11］。此外，药物清除还受到脑间质容积分数和迂曲度的影响，由脑缺血引起的细胞水肿，将会缩小脑间质的容积分数［12］，增加迂曲度，从而降低药物的清除速率，这可能也是CDPC药效得以充分发挥的重要原因。

总之，本研究确定了经脑间质微穿刺注射CDPC治疗脑缺血的有效药物剂量范围，为经脑间质途径的微创给药治疗提供了有价值的参考依据。

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