自体成肌细胞甲杓肌注射治疗创伤性声门关闭不全的实验研究

闫飚 孙敬武 邹嘉平 张磊

创伤性声门关闭不全多指多种原因引起的声带麻痹或声带外伤疤痕形成后， 声带体积减小，声门闭合不全，导致声音嘶哑、呼吸困难、发音无力及误咽等[1]，如果不及时治疗可能导致声带及甲杓肌萎缩，文献报道这类声带运动障碍如果三个月不能恢复正常，自愈的可能性不大，应视为手术适应症[2]。自体组织声带注射是近年常用的治疗声门闭合不全的有效方法。骨骼肌成肌细胞是干细胞的一种，位于成人肌肉表面，以卫星细胞存在[3]，又称为卫星细胞，具有其他干细胞所具有的基本特征。近年来成肌细胞移植己由实验阶段[4～6]初步走向临床应用，移植途径主要为直接注射[7，8]。最近有学者[9，10]用带有荧光标记的成肌细胞注入去神经支配的声带肌，结果注入的成肌细胞活性增加且与去神经的肌纤维广泛融合。本研究拟通过甲杓肌注射自体成肌细胞治疗一侧声带失去喉返神经支配且疤痕萎缩致声门闭合不全的实验研究，观察萎缩的声带容积及甲杓肌直径的变化，探讨其对创伤性声门关闭不全的疗效。

1 材料与方法

1.1实验动物及材料 20只成年新西兰大白兔，雌雄不限，体重1.5～2.0 kg，由安徽医科大学实验动物中心提供。

主要试剂及仪器：D-BPS 、DMEM/F12培养基(GIBCO公司)，bFGF(美国GIBCO 公司), 胎牛血清(Hylcone公司)，透明质酸酶，链酶蛋白酶，胰蛋白酶( Sigma公司) ，一抗：Rabbit anti-Desmin， Rabbit anti-SMA(博奥森)，SABC试剂盒，DAB显色试剂盒(Zymed)。显微镜CX-40 (日本 Olympus公司)图象分析系统Motic image advanced(3.2北京)。

1.2创伤性声门闭合不全动物模型的建立 20只动物均在无菌条件下于第2～4气管环水平切除左侧喉返神经1 cm，近心端结扎并缝于皮下，同时取出左侧胸锁乳突肌(供成肌细胞培养用)缝合切口；再在直达喉镜下，暴露声门，细钩针于左侧声带表面划痕，深度达声带肌层，制成创伤性声门关闭不全的模型。

1.3骨骼肌成肌细胞混悬液的制作 将取出的实验兔左侧胸锁乳突肌，转入超净台，采用两步消化法和非连续密度梯度离心法分离及纯化成肌细胞，并进行培养及传代培养。按SABC试剂盒说明书的方法对培养的细胞进行结蛋白免疫组化染色。

1.4骨骼肌成肌细胞注射 建立动物模型12周后，20只大白兔随机分成A、B两组，每组10只，细胞移植前两组动物均连续1周腹腔注射免疫抑制剂环孢菌素A 50 mg·kg-1·d-1。动物以2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，支撑喉镜暴露声门，显微镜下以喉显微注射器将成肌细胞混悬液(0.3 ml)注射于A组兔左侧萎缩声带中部及声带突旁甲杓肌内(注射时稍过量，使矫正的声带越过中线，声带游离缘扩散成一光滑轮廓)，B组同法于左侧声带注射等量的生理盐水。注射完毕后两组动物均腹腔注射1周环孢菌素A50 mg·kg-1·d-1。两组动物均以右侧声带为正常对照。注射12周后观察两组动物双侧甲杓肌纤维直径和对应声带体积。

1.5甲杓肌组织形态学观察 自体成肌细胞注射杀死实验兔，取出双侧甲杓肌，行横、纵切面切片，片厚4 μm，常规行HE染色及免疫组化染色。于光镜下分别观察双侧甲杓肌肌纤维的大体形态，横截面积，纤维数量及细胞核数的变化，肌原纤维、胞核的分布及形态变化等。用Motic image advanced 3.2图像分析系统测定标本肌纤维横截面积，每张切片中测量100个肌细胞的直径，自动计算均数。

1.6声带体积的测量 切取动物双侧声带，吸去表面血液，放入一毫升注射器中，加入生理盐水达到一毫升刻度，然后把这些生理盐水注入到另一个一毫升注射器中，测得体积，一毫升减去所得的生理盐水体积即为声带的体积。

1.7统计学方法 用SPSS13.0 统计软件对数据进行分析。自体甲杓肌直径和声带体积的变化用配对资料的t检验，组间甲杓肌直径和声带体积的比较用独立样本资料的t检验。

2 结果

20只大白兔在实验过程中均无自然死亡。

2.1成肌细胞培养结果 培养48小时后成肌细胞呈扁平状,胞浆十分丰富,折光性强。4～5天后逐渐展现细胞形态，早期细胞呈梭形或纺锤形，多为骨骼肌成肌细胞，随细胞生长时间的延长，成肌细胞增殖且相互融合并逐渐沿一个方向平行排列，逐渐形成多核的肌管，且铺满瓶底。骨骼肌源性中间丝蛋白desmin在成肌细胞胞质中呈强阳性表达，胞质染色呈棕色或棕黄色，成纤维细胞及其他杂质细胞不着色(图1)。

2.2甲杓肌组织形态学观察 成肌细胞注射12周后可见两组右侧甲杓肌(正常对照侧)HE染色见肌纤维横切面呈圆形或不规则多边形，粗大，多核，肌纤维断面呈细点状，核位于肌膜边缘；纵切面肌浆内有许多与细胞长轴平行排列的肌原纤维，排列较整齐。正常对照侧甲杓肌纤维平均直径为72±10.43 μm。

B组左侧甲杓肌严重萎缩，肌纤维形态散乱，大小各异，可见断裂纤维相，核减少，可见核固缩深染或呈链状排列，可见少量胶原纤维增生(图2)。B组左侧甲杓肌肌纤维平均直径54±8.76 μm。

图1 成肌细胞desmin表达(SABC×200)图2 B组成肌细胞注射12周后甲杓肌横截面HE染色(×200)图3 B组成肌细胞注射12周后甲杓肌横截面desmin表达(SABC×200)图4 A组成肌细胞注射12周后甲杓肌横截面desmin表达(SABC×200)

A组左侧甲杓肌肌膜核排列渐整齐，呈链状，核聚集减少，肌原纤维松散，肌纤维间界限不清。较正常对照组纤维结缔组织增生、炎症细胞浸润明显，部分区域存在大量的混杂不清的细胞及胶原纤维，其中可见淋巴细胞、分叶状核的中性细胞及毛细胞血管增多。A组左侧甲杓肌肌纤维平均直径72±11.60 μm。

2.3甲杓肌免疫组化染色镜下观察 B组左侧甲杓肌纵切面肌纤维粗细不等，形状不一，肌纤维明显萎缩，排列不整齐，间距大小不等，肌纤维周围成肌细胞较少；甲杓肌横切面见肌纤维横截面大多呈不规则型，大小不一，肌纤维间有的界限不清，甚至相互融合，肌纤维周围成肌细胞较少，可见desmin表达较弱(图3)；A组左侧甲杓肌纵切面肌纤维粗细基本相等，形状基本相同，肌纤维较粗，排列整齐，间距大小基本相等，肌纤维周围成肌细胞较多；肌纤维横截面积多呈圆形或长方形，粗细相差不大，肌纤维之间界限基本清楚，肌纤维周围成肌细胞较多并且基本呈均匀分布，可见desmin表达较强(图4)。

2.4声带体积和甲杓肌直径测量结果 两组声带体积测量结果见表1，甲杓肌直径测量结果见表2，可见，A组声带体积和甲杓肌直径均大于B组(P<0.05)，而与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。A组左侧声带体积平均0.258±0.025 ml，B组平均0.221±0.0227 ml，正常对照侧平均0.257±0.0156 ml。

表1 A、B两组左侧声带注射12周后及正常对照侧的声带体积(ml)

注：与B组比较，t=3.4，P<0.05

表2 A、B两组左侧声带注射12周后及正常对照侧甲杓肌纤维平均直径

注：与B组比较，t=3.75，P<0.05

3 讨论

骨骼肌受周围神经的支配，肌肉的长期运动及其结构和功能的维持都依靠相应运动神经纤维的调节。Sunderlang[11]发现运动神经元与骨骼肌细胞之间还存在其他复杂关系，这些关系是不依赖于神经冲动的。肌细胞维持正常的形态结构需要一些神经营养因子的作用，如失神经支配时，首先表现为肌纤维直径和横截面积的改变。既往研究[12]表明肌纤维横截面积于失神经2个月时下降70%，其后逐渐减缓，于4个月时下降80%，最终横截面积可以减少80% ～ 90%。本研究切断了实验动物左侧喉返神经可使声带失神经支配而萎缩，同时以锐器创伤同侧声带使之疤痕形成后更加重了声带的萎缩，便于更好地观察甲杓肌注射自体成肌细胞后对创伤性声门闭合不全的治疗效果。结果显示，注射生理盐水的B组术侧甲杓肌的肌纤维直径和声带体积较正常对照组明显缩小，而注射自体成肌细胞的A组术侧与健侧及B组相比较，甲杓肌纤维直径和声带体积等缩小不明显，说明甲杓肌注射成肌细胞可以有效防治其肌肉萎缩。

一般情况下成肌细胞处于静止状态，一旦肌肉受创伤，成肌细胞即被激活，进入有丝分裂周期，彼此融合且与受损的肌纤维融合以保持和恢复骨骼肌结构和功能的完整。本研究中，A组左侧甲杓肌和声带未发生明显萎缩，可能与以下因素有关：①注射后的成肌细胞具有一定的移行潜能，成肌细胞可以存活并分化为骨骼肌肌纤维；②存活的成肌细胞可通过局部分泌细胞因子特别是生长因子刺激甲杓肌干细胞的产生和声带上皮细胞增生完成自身修复，产生更多的功能细胞。

本研究结果显示自体成肌细胞的提取和体外增殖成功，说明制备自体成肌细胞切实可行。自体成肌细胞注射12周后甲杓肌肌纤维周围成肌细胞明显增多，说明注射的成肌细胞已成活并与宿主细胞很好的融合，一方面注射的成肌细胞使甲杓肌在失神经支配时直径增加，另一方面使疤痕挛缩的声带体积增加，可有效的治疗声门闭合不全。说明自体成肌细胞甲杓肌注射对创伤性声门关闭不全的治疗具有可行性，但其具体机制还需进一步探索。

4 参考文献

1 Koufman JA,Postma GN,Cummins MM,et al.Vocal fold paresis[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2000,122:537.

2 宋明明.杨宝琦.单侧声带麻痹手术治疗方法探新[[J ].天津医药,1996，24:111.

3 Jankowski RJ, Deasy BM, Huard J. Muscle-derived stem cell[J]. Gene Ther,2002,9:642.

4 Chhetri DK, Head C, Revazova E, et al. Lamina propria replacement therapy with cultured autologous fibroblasts for vocal fold scars[J]. Otolaryngol Head Neck Surg,2004,131:864.

5 Halum SL, Naidu M, Delo DM,et al. Injection of autologous muscle cell (MSCs) for the treatment of vocal fold paralysis: a pilot study[J]. Laryngoscope, 2007, 117:917.

6 Kanemaru S, Nakamura T, Omori K. Regeneration of the vocal fold using autologous mesenchymal stem cells[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,2003,112:915.

7 McCue JD, Sw ingen C, Feldberg T, et al The real estate of myo-blast cardiac transplantation: negative remode ling is associated with locatbn [J].J Heart Lung Transplant, 2008,27:116.

8 Pagani FD, DerSmon ian H, Zawadzka A, et al Auto logous skeletal myoblasts transplanted to ischem ia-damaged myocardiun in humans histological analysis of cell survival and differentiation[J].J Am Coll Canliol, 2003, 41:879.

9 Halum SL, Hiatt KK, Naidu M, et al. Optimization of autologous muscle stem cell survival in the denervated hemilarynx[J]. Laryngoscope, 2008, 118:1 308.

10 Murakami Y, Kirchner JA.Vocal cord abduc- tion by regenerated recurrent laryngeal nerve. An experimental study in the dog[J]. Arch Otolaryngol,1971,94:64.

11 Sunderlang S. Factors influencing the development and severity of the changes in denervated muscle[M]. London: Sunderlands，1991.1 576～1 579.

12 Sunderland S. Factors influencing the development and severity of the changes in denervated muscle//Nerve injury and their repair: a critical appraisal[M]. London: Sunderlands, 1991.241～263.