MicroRNAs在植物响应金属毒性中的作用

肖 莉，刘 春，向世鹏，彭晚霞

（1.衡南县烟草公司，衡阳市烟草公司烟草科学研究所，湖南 衡阳 421001；2.衡阳师范学院 生命科学系，湖南 衡阳 421008；3.中国烟草中南农业试验站，湖南 长沙 410128；4.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 410125）

金属毒性是影响作物产量的一个主要胁迫因子。包括植物必需的金属，如铜、铁、锌、锰，和非必需金属，如镉、铝、钴、汞。高浓度的铝、铜、镉或汞等金属对植物的一个主要且普遍的影响是抑制根的生长。金属毒性能触发活性氧的积累从而导致脂质、蛋白质和DNA的损伤。植物对金属毒性的响应涉及几个需要在转录和转录后水平被精确调控的生物过程。microRNAs（miRNAs）是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRNA的碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA的组织特异性和时序性，决定了组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长发育和生物与非生物胁迫响应的调节过程中起多种作用。

1 植物对金属毒性的响应

随着人类活动对地球生态系统的影响加剧，植物不断暴露于众多的非生物和生物胁迫中。一种重要的非生物胁迫是金属毒性。重金属如铜（Cu）、铁（Fe）和锌（Zn）对于植物生理和生化过程来说是必需的，而镉（Cd）、钴（Co）、汞（Hg）和铝（Al）等则不是必需的。然而，高浓度的任何金属类型对植物都是有毒的。

根尖是根最敏感的部位，因此Al、Cu、Cd和Hg等金属的毒性主要表现在抑制根的生长［1］。植物对金属毒性的响应和处理包括合成参与脱毒的多种蛋白质，如金属硫蛋白（Metallothionein）、植物螯合肽（Phytochelatin）和谷胱甘肽（Glutathione），它们具有选择性和高亲和力重金属结合位点。根分泌柠檬酸、草酸、苹果酸和组氨酸等有机酸至根际是一个重要的生理响应，因为这些复合物能与重金属形成复合物从而脱毒［2］。

几种金属转运蛋白的表达对于金属毒性耐受性是必需的。ABC转运蛋白（ATP－binding cassette）家族介导Al和Cd的转 运［3］。NRAMP（natural resistance－associated macrophage protein）家族能对Cd、Mn和Zn的转运进行调控［4］。CDF（cation diffusion facilitator）家族参与二价金属阳离子的细胞质分泌和液泡隔离，从而在Zn、Cd、Co、Ni或Mn等金属脱毒方面起作用［5］。已把源自P型ATP酶离子泵系统的转运蛋白与Cu、Zn、Cd和Pb等重金属的转运体联系起来［6］。

金属毒性胁迫会触发活性氧（ROS）的积累，抗氧化酶类的活性被这种胁迫上调而失去平衡［7］。氧化胁迫导致脂质、蛋白质和DNA的损伤。

植物对非生物胁迫如金属毒性的响应涉及转录和转录后水平对基因表达的精确调控。调控可以通过来自MYB、bZIP、ERF和WRKY等 不 同 家 族 的 转 录 因 子 而 实 现［5，8－10］。已在生长素调控基因—parA等金属响应基因的启动子区域鉴定出顺式作用元件，parA在烟草（Nicotiana tabacum）中参与对Cd的响应［11］。已在来自绿藻（Chlamydomonas reinhardtii）的粪生素氧化酶和细胞色素c6基因的启动子中鉴定出具有共有序列GTAC的铜响应元件（CuRE）［12］。来自Phaseolus vulgaris的PvSR2基因的两个启动子区域含有重金属响应元件（HMREs）［13］。

小和／或大的非蛋白质编码RNAs（npcRNAs）可能参与金属毒性响应的调控／信号转导［14］。研究得最多的一类npcRNAs是microRNAs（miRNAs）。miRNAs是21个核苷酸的npcRNAs，在转录后水平调控植物的基因表达。具不完美的发夹结构的前体miRNA（pre－miRNA）被加工成成熟的miRNA并整合到RNA诱导的沉默复合物（RISC）中从而启动与其碱基互补的靶mRNA（s）的降解／清除［15］。虽然在拟南芥中鉴定出的大部分miRNAs与植物的发育有关，但有证据表明miRNAs在植物响应包括金属毒性在内的不同非生物胁迫方面也发挥作用［16］。

2 响应金属毒性的miRNAs及其靶标

对暴露于金属毒性下的植物的小RNAs表达谱的分析表明miRNA及其靶标是差异表达的，从而揭示了它们在调控／信号转导途径中的可能作用。为确定特异miRNA的作用，对其靶标的功能以及它们与金属毒性响应相关信号转导途径之间可能的互作分析是重要的。大部分响应金属毒性的保守性miRNAs的预测靶标是一些主要参与植物发育的转录因子（表1）。某种miRNA的上调导致其靶标的降解可能表明靶标作为对金属毒性响应的负调节子而起作用。最近高通量基因组技术和其他遗传学途径拓展了我们有关miRNAs的现有知识，以及它们在几种植物响应金属毒性的信号转导途径中的靶标［17－20］。

表1 响应金属毒性的miRNAs

关于响应Cd毒性的miRNAs：miR160、miR164和miR167以及新的Osa－miR602和Osa－miR604，已从暴露于Cd的水稻幼苗的小RNAs库中鉴定出来［17］。Osa－miR602在暴露于高Cd浓度下12小时的水稻根部中被上调，它的预测靶标是木葡聚糖内转糖基化酶／水解酶。Osa－miR604在用毒性水平的Cd处理6小时后的叶片中被上调，脂质转移蛋白（LPT）被下调［17］。这类蛋白质响应环境胁迫并被认为参与角质和蜡质的组装以及植物对病原菌的防御［21］。水稻微阵列数据显示在Cd胁迫下miR528被上调，而miR162、miR166、miR171、miR390、miR168和miR156家 族 被 下调［18］。搜索可能的响应金属的顺式作用元件揭示了一个类MRE序 列（5’－TGCGCNC－3’）存 在 于 大 多 数 响 应Cd的miRNA基因的启动子区域［18］。与不同非生物胁迫相关的其他顺式作用元件如ARE（anaerobic－responsive element）、ABRE（ABA－responsive element）、GARE（gibberellins－responsive element）、ERE（ethylene－responsive element）、HSE（heat stress－responsive element）和LTR（low temperatureresponsive element）等也发现存在于这些miRNA基因的启动子中，从而暗示这些miRNAs可能响应除金属毒性以外的其他胁迫信号［18］。暴露于Cd下8小时后的油菜根中的miR393、miR171、miR156和miR396被下调［22］。

暴露于Cd、Hg和Al 24小时后的模式豆科植物Medicago truncatula叶子中的miR393、miR171、miR319和miR529被上调，而miR166和miR398被下调［23］。一高通量小RNA测序方法揭示在对Al的响应中miR159、miR160、miR319、miR396和miR390被下调［19］。新近利用类似方法的一项研究在Medicago truncatula鉴定出了响应Hg毒性的miRNAs如miR167、miR172、miR169、miR164、miR395家族被上调，而miR396、miR390和miR171被下调。此外，在M.truncatula中鉴定出一个新的响应Hg的miRNAs如靶向编码TIR－NBSLRR病抗性蛋白转录因子的miR2681［20］。

有关不同植物响应金属的miRNAs的现有信息揭示了miR319、miR390、miR393和miR398具有普遍的相关作用。

3 miR319、miR390、miR393和miR398的作用

3.1 miR319

植物的生长和衰老是受金属毒性影响的过程［24］。幼苗对Al和Cu毒性的常见反应包括叶片细胞和超微结构的改变，光合活性的降低导致叶片黄化和坏死，总的叶片数量和大小降低，以及幼苗的生物量减少［25］。此外，Cu毒性会导致叶片的快速衰老。有趣的是，miR319及其靶标TCP（Teosinte Branched／Cycloidea／PCF）转录因子（表1），涉及生长调控，在大多数响应金属毒性的miRNAs研究中已被证明是差异化表达的。结合启动子元件的TCP家族成员对于增殖细胞核抗原（PCNA）基因的表达是必需的［26］。其他的TCPs参与幼苗侧生器官形态发生［27］。近来，已证明miR319在叶片衰老方面起作用，该作用是通过茉莉酸生物合成和重要的衰老正调控子如WRKY53来正调控涉及叶片衰老的TCPs实现的［28］。

图1描述了miR319和TCP的作用模式。在叶片中，高Cd、Hg和Al诱导的miR319导致TCP的降解从而影响生长和衰老。在根中，miR319在对Al的响应中被抑制但在对Mn毒性的响应中被诱导［19，29］。当土壤中两种金属都丰富时，Al可能对Mn的吸收发挥拮抗作用从而减轻Mn毒性［30］。目前没有有关当植物根暴露于Al和Mn组合时miR319调控的报道，我们发现关于这个问题的推测是困难的，因为在植物中特异作用将依赖于金属浓度、暴露时间、环境条件等几个变量。

图1 对金属毒性的响应中miR319、miR393和miR398的作用模式图

3.2 miR390

在不同植物中的miR390及其靶标TAS3（表1）均表现出与响应金属毒性有关。miR390诱导的TAS3转录本的切割起始ta－siRNAs（trans－acting small inter－ference RNAs）的生物发生，导致在侧根发育中起关键作用的ARFs（auxin response factors）的降解［31］。在Cd、Hg和Al毒性下植物根中的miR390被抑制，而使完整的TAS3转录本积累和tasiARFs的减少，最终导致抑制侧根的生长（图1）［20］。

暴露于高Cu下的拟南芥植株显示减少了主根的生长而增加了短侧根的密度。同样，在暴露于Cu下的植株中观察到其主根和次生根根尖中有丝分裂活性、生长素和细胞因子在积累方面的改变［1］。我们可以推测miR390及其靶标可能也响应Cu毒性，但目前没有有关Cu胁迫响应中存在miR390调控的信息。

3.3 miR393

miR393受Cd、Hg和Al毒性的诱导［22－23］。这些金属在叶片中诱导产生miR393，这将导致其靶标F－box生长素受体TIR1／AFBs和bHLH转 录 因 子 受 到 抑 制（表1）［32］。TIR1正调控生长素信号转导，miR393的增加导致生长素信号转导受到抑制从而使TIR1处于较低的水平。研究显示miR393在叶片发育、根系形态建成和根的生长方面起着重要的调控作用（图1）［33］。这个miRNA也响应Pseudomonas syringae细菌感染和盐分胁迫［32］。

根是受土壤中高浓度金属影响的主要器官，常见的表型响应是株型的改变［34］。在这样的响应中miR393和miR390可能起了相关的调控作用。

3.4 miR398

miR398是在受氧化胁迫的调控中鉴定出的第一个miRNA，其靶标是Cu／Zn超氧化物歧化酶（CSD）酶类：胞质CSD1和膜CSD2如COX5b.1、线粒体细胞色素氧化酶的5b亚基（表1）。CSDs是清除超氧自由基从而释放分子氧和过氧化氢的酶类［35］。CSD2mRNA序列与miR398的互补序列位于编码序列内而CSD1和COX5b.1转录本在5’UTR中含miR398互补序列［36］。

miR398启动子含有响应Cu的具有重要特征的GTAC序列［37］。这一模序能被SPL7转录因子识别，该转录因子能结合miR398并调控miR398的表达。此外，这个转录因子也调控其他Cu相关miRNAs如miR397、miR408和miR857等的表达［38］。GTAC启动子序列也出现在其他重要的Cu响应基因如在Cu缺乏下能增强Cu吸收能力的CPX1（coproporphyrinogen oxidase）和Cyc6（cytochrome 1c6）中［12］。

氧化胁迫抑制miR398的表达对于CSD1和CSD2转录本的积累是必不可少的（图1）。暴露于Cu2＋和Fe3＋［16］等重金属下miR398被下调，Cu2＋和Fe3＋能参与Fenton式反应且有产生羟自由基的潜力［39］。此外，miR398在对强光和甲基紫精的响应中被下调，此时CSD1和CSD2的转录本水平通常是增加的［16］。

过表达miR398前体的共抑制转基因品系显示在幼苗发育和脂质过氧化速率方面对Cu2＋和MV胁迫的耐受性增强［16］。相反，一些报道指出同时过表达miR398b和miR398c是可能的且过表达品系表现出降低了CSD1和CSD2水平，但COX5b.1、mRNA和蛋白质水平没受影响［40］。

蔗糖是miR398表达的一个重要信号，它正调控miR398的积累。蔗糖水平与CSD1和CSD2蛋白质水平相一致，但COX5b.1的水平随着蔗糖水平的增加而降低。通过蔗糖而增加的miR398水平在存在和缺乏Cu的情况下都能维持，因此蔗糖和Cu对miR398的调控是独立的［40］。

最近鉴定出超氧化物歧化酶（SOD）的Cu分子伴侣是miR398的一个靶标，当Cu缺乏时它的mRNA切割是受miR398介导的［41］。Beauclair等（2010）［41］认为通过miR398的SOD调控能响应未改变的CSD1和CSD2的蛋白质水平，该蛋白质水平是在表达抗miR398形式的CSD1或CSD2的植物研究中出现的［40］。

显然，非生物胁迫如Cu2＋、Fe3＋、强光、MV、臭氧、盐分和生物胁迫的共用信号是ROS的积累。ROS的产生和活性抗氧化酶类的合成均是对金属毒性的一个普遍反应。特异响应的miR398或其他ROS响应的miRNAs可能会根据金属种类和暴露于金属胁迫下的时间而变化（图1）。

4 结 论

通过对响应不同金属毒性的miRNAs的分析和鉴定，表明它们参与植物适应这些非生物胁迫的调控网络。由此我们可以预测更多新的响应金属胁迫的miRNAs的存在。为深入理解miRNAs及其靶标、以及阐明其作为植物响应环境改变的信号转导途径之一的机理，进一步的研究是必要的。而且我们应当考虑不同植物物种生长习性和基因型背景的差异而可能存在对金属胁迫差异响应的miRNAs。暴露于金属下的时间长短、金属的不同浓度和不同种类金属的组合诱导的miRNAs及其靶标动力学的详细研究将有助于我们深刻理解miRNAs在胁迫调控中的详细作用机制，这将有助于设计出增强作物胁迫耐受性的更好的策略。

［1］Lequeux H，Hermans C，Lutts S，et al.Response to copper excess in Arabidopsis thaliana：impact on the root system architecture，hormone distribution，lignin accumulation and mineral profile［J］.Plant Physiol Biochem，2010，48：673－682.

［2］Hall JL.Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance［J］.J Exp Bot，2002，53：1－11.

［3］Huang CF，Yamaji N，Chen Z，et al.A tonoplast－localized half－size ABC transporter is required for internal detoxification of aluminum in rice［J］.Plant J，2012，69：857－867.

［4］DalCorso G，Farinati S，Furini A.Regulatory networks of cadmium stress in plants［J］.Plant Signal Behav，2010，5：663－667.

［5］Krámer U，Talke IN，Hanikenne M.Transition metal transport［J］.FEBS Lett，2007，581：2263－2272.

［6］Lee S，Kim YY，Lee Y，et al.Rice P1B－type heavy－metal ATPase，OsHMA9，is a metal efflux protein［J］.Plant Physiol，2007，145：831－842.

［7］Romero－Puertas MC，Corpas FJ，Rodriguez－Serrano M，et al.Differential expression and regulation of antioxidative enzymes by cadmium in pea plants［J］.J Plant Physiol，2007，164：1346－1357.

［8］Jacoby M，Weisshaar B，Vicente－Carbajosa J，et al.bZIP transcription factors in Arabidopsis［J］.Trends Plant Sci.2002，7：106－111.

［9］Wei W，Zhang Y，Han L，et al.A novel WRKY transcriptional factor from Thlaspi caerulescens negatively regulates the osmotic stress tolerance of transgenic tobacco［J］.Plant Cell Rep，2008，27：795－803.

［10］Farinati S，DalCorso G，Varotto S，et al.The Brassica juncea BjCdR15，an ortholog of Arabidopsis TGA3，is a regulator of cadmium up take，transport and accumula－tion in shoots and confers cadmium tolerance in transgenic plants［J］.New Phytol，2010，185：964－978.

［11］Kusaba M，Takahashi Y，Nagata T.A multiple－stimuliresponsive as－7－related element of parA gene confers responsiveness to cadmium but not to copper［J］.Plant Physiol，1996，111：1161－1167.

［12］Quinn JM，Barraco P，Eriksson M，et al.Coordinate copper and oxygen－responsive Cyc6and Cpx1expression in Chlamydomonas is mediated by the same element［J］.J Biol Chem，2000，275：6080－6089.

［13］Qi X，Zhang Y，Chai T.Characterization of a novel plant promoter specifically induced by heavy metal and identification of the promoter regions conferring heavy metal responsiveness［J］.Plant Physiol，2007，143：50－59.

［14］Ben Amor B，Wirth S，Merchan F，et al.Novel long non－protein－coding RNAs involved in Arabidopsis differentiation and stress responses［J］.Genome Res，2009，19：57－69.

［15］Jones－Rhoades MW，Bartel DP，Bartel，B.MicroRNAs and their regulatory roles in plants［J］.Annu Rev Plant Biol，2006，57：19－53.

［16］Sunkar R，Kapoor A，Zhu JK.Posttranscriptional induction of two Cu／Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance［J］.Plant Cell，2006，18：2051－2065.

［17］Huang SQ，Peng J，Qiu CX，et al.Heavy metal－regulated new microRNAs from rice［J］.J Inorg Biochem，2009，103：282－287.

［18］Ding Y，Chen Z，Zhu C.Microarray－based analysis of cadmium－responsive microRNAs in rice（Oryza sativa）［J］.J Exp Bot，2011，62：3563－3573.

［19］Chen L，Wang T，Zhao M，et al.Identification of aluminum－responsive microRNAs in Medicago truncatula by genome－wide high－throughput sequencing［J］.Planta，2012，235：375－386.

［20］Zhou ZS，Zeng HQ，Liu ZP，et al.Genome－wide identification of Medicago truncatula microRNAs and their targets reveals their different regulation by heavy metal［J］.Plant Cell Environ，2012，35：86－99.

［21］Kim TH，Park JH，Kim MC，et al.Cutin monomer induces expression of the rice OsLTP5lipid transfer protein gene［J］.J Plant Physiol，2008，165：345－349.

［22］Xie FL，Huang SQ，Guo K，et al.Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus［J］.FEBS Lett，2007，581：1464－1474.

［23］Zhou ZS，Huang SJ，Yang ZM.Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，374：538－542.

［24］Maksymiec W.Signaling responses in plants to heavy metal stress［J］.Acta Physiol Plant，，2007，29：177－187.

［25］Panou－Filotheou H，Bosabalidis AM，Karataglis S.Effects of copper toxicity on leaves of oregano（Origanum vulgare subsp.hirtum）［J］.Ann Bot，2001，88：207－214.

［26］Kosugi S，Ohashi Y.PCF1and PCF2specifically bind to cis elements in the rice proliferating cell nuclear antigen gene［J］.Plant Cell，9：1607－1619.

［27］Li C，Potuschak T，Colón－Carmona A，et al.Arabidopsis TCP20links regulation of growth and cell division control pathways［J］.Proc Natl Acad Sci U.S.A，2005，102：12978－12983.

［28］Schommer C，Palatnik JF，Aggarwal P，et al.Control of jasmonate biosynthesis and senescence by miR319targets［J］.PLoS Biol.2008，6，e230.doi：10.1371／journal.pbio.0060230.

［29］Valdés－López O，Yang SS，Aparicio－Fabre R，，et al.MicroRNA expression profile in common bean（Phaseolus vulgaris）under nutrient deficiency stresses and manganese toxicity［J］.New Phytol，2010，187：805－818.

［30］Yang ZB，You JF，Xu MY，et al.Interaction between aluminum toxicity and manganese toxicity in soybean（Glycine max）［J］.Plant Soil，2009，319：277－289.

［31］Marin E，Jouannet V，Herz A，et al.miR390，Arabidopsis TAS3tasiRNAs，and their AUXIN RESPONSE FACTOR targets define an autoregulatory network quantitatively regulating lateral root growth［J］.Plant Cell，2010，22：1104－1117.

［32］Navarro L，Dunoyer P，Jay F，et al.A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling［J］.Science，2006，312：436－439.

［33］Chen ZH，Bao ML，Sun Y Z，et al.Regulation of auxin response by miR393－targeted transport inhibitor response protein 1is involved in normal development in Arabidopsis［J］.Plant Mol Biol，2011，77：619－629.

［34］Kochian LV，Pi？eros MA，Hoekenga OA.The physiology，genetics and molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity［J］.Plant Soil，2005，274：175－195.

［35］Kliebenstein DJ，Monde RA，Last RL.Superoxide dismutase in Arabidopsis：an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization［J］.Plant Physiol.1998，118：637－650.

［36］Sunkar R，Zhu J.Novel and stress－regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis［J］.Plant Cell，2004，16：2001－2019.

［37］Yamasaki H，Hayashi M，Fukazawa M，et al.SQUAMOS A promoter binding protein－like 7is a central regulator for copper homeostasis in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2009，21：347－361.

［38］Ding YF，Zhu C.The role of microRNAs in cooper and cadmium homeostasis［J］.Biochem Biophys Res Commun.2009，386：6－10.

［39］Estevez MS，Malanga G，Puntarulo S.Iron－dependent oxidative stress in Chlorella vulgaris［J］.Plant Sci.2001，161：9－17.

［40］Dugas DV，Bartel B.Sucrose induction of Arabidopsis miR398represses two Cu／Zn superoxide dismutases［J］.Plant Mol Biol，2008，67：403－417.

［41］Beauclair L，Yu A，BouchéN.MicroRNA－directed cleavage and translational repression of the copper chaperone for superoxide dismutase mRNA in Arabidopsis［J］.Plant J.2010，62：454－462.