miRNA-30在肿瘤细胞中的作用

张骞 王锡山

microRNA(miRNAs)是一种长度约为22核苷酸的非编码的单链小RNA，由内源基因编码，主要功能是负性调节靶基因的表达。从1993年 Lee和 Ambros［1］在 C．elegans中发现lin-4以来，至今发现的miRNAs已经超过1 000种。成熟的miRNAs分子的形成过程包含若干个步骤:miRNAs基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录合成原始microRNA(primicroRNA)，pri-microRNA 具有5’端的帽子、3’端的polyA 尾的结构;pri-microRNA经过两次酶的剪切产生成熟的miRNAs。动物 pri-microRNA第一次剪切在细胞核内，经Dorsha酶剪切产生大小约70个核苷酸并形成茎环结构的microRNA前体(pre-microRNA);pre-microRNA通过Ran-GTP依赖性核浆转运子Exportin5从核内转移至细胞质中。在细胞质中，Dicer酶将pre-microRNA剪切形成一个不完全配对的双链RNA片段即microRNA和microRNA*双体，其中一条形成成熟的21～23个核苷酸长度的microRNA分子，另一条则可能迅速降解。成熟的microRNA形成RNA诱导复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，从而引起靶基因mRNA降解或翻译抑制。miRNA与靶基因的mRNA 3’端非翻译区(3’-UTR)完全或部分结合，使得mRNA降解或抑制翻译产物的生成，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化。目前报道的miRNAs靶基因大约有5300个。一个miRNA可以与多个mRNA结合，而一个mRNA可以同时被多个miRNAs调节，据统计约30%的基因受到 miRNA的调节。

肿瘤是由细胞增殖和损伤细胞存活引起的。细胞本身有多种机制，调控细胞正常的分裂、分化和死亡。通过一系列基因的活化或沉默精确地调节细胞增殖和分化。在肿瘤细胞当中，可以选择性的开启或关闭某些癌基因、抑癌基因的功能。大部分癌基因和抑癌基因首先由DNA转录成RNA，然后再翻译成相应的蛋白，从而发挥对应的生物学功能。而miRNAs可以通过与靶mRNA结合，来发挥类似于“抑癌因子”和“促癌因子”的功能。miRNA-30家族作为miRNA s的重要组成部分，在人类和动物miRNA的功能研究中起着不容忽视的作用。miRNA-30包括miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d 和 miR-30e。这五个 miRNAs可以分为三簇:miR-30a和 miR-30c-2，miR-30d和 miR-30b，miR-30e和 miR-30c-1［2］。

一、肝癌

肝细胞癌(hepatocute carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，尤其在东亚和南非地区是首要致死疾病。miRNA-30通过与靶基因作用可以影响HCC细胞的增殖、侵袭、转移。Yao等［3］通过 qRT-PCR方法检测到 miR-30d在HCC细胞中表达上调，Transwells实验表明miR-30d可以促进体外HCC细胞的转移和侵袭能力，体内实验表明miR-30d可以促进HCC肝内和肺转移。结合生物信息学方法和构建荧光素酶载体等，证实Galphai2(GNAI2)为其靶基因。并且Galphai2(GNAI2)在HCC细胞中表达下调，且具有抑制HCC细胞转移和侵袭的能力。miR-30d通过负向调节Galphai2的表达可以促进HCC细胞的侵袭和转移能力。Anuradha Budhu等［4］通过对241例HCC患者的根治切除标本分析，通过qRT-PCR筛选出了20个差异表达的miRNAs，其中 miR-30c、miR-30a和 miR-30e的表达是下降的，并且miR-30c为表达水平较低的miRNAs之一。通过对转移和生存率的分析，发现miR-30c、miR-30a和miR-30e与转移成负相关，和生存率成正相关。

二、乳腺癌

Yu等［5］的研究表明miR-30家族可以与其靶基因Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme 9)和 ITGB3(integrinb3)作用，来影响乳腺肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells，BT-Ics)的活性。miR-30在BT-ICs中表达减少，Ubc9和ITGB3的表达上调。miR-30可以通过减少Ubc9的表达来抑制BT-ICs的自我更新能力，而通过沉默ITGB3诱导BT-ICs的凋亡。Li等［6］通过微阵列比较基因组杂交技术(Array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)和功能文库筛选方法(Functional Library Screening)对109例卵巢癌和73例乳腺癌标本进行分析，发现miR-30d表达增加。体外实验表明miR-30d可以促进乳腺癌细胞的生长;抑制miR-30d可以观察到细胞周期明显停滞在G0/G1期;同时观察到典型的衰老形态细胞;miR-30同时可以减少caspase-3的表达，抑制癌细胞的凋亡;体内实验表明抑制miR-30d可以抑制肿瘤的生长;结合生物信息学的方法证实caspase-3可能为miR-30d的靶基因。EMT(epithelial-metastasis transition)是肿瘤转移中常见过程，E-cadherin在EMT的过程中发挥了重要的作用，在EMT过程中E-cadherin的表达下降，而N-cadherin的表达增加。Cheng等［7］的实验表明miR-30a与其靶基因Vim作用，可以抑制乳腺癌细胞系Hs578T和MDA-MB-231的EMT过程，抑制侵袭和转移能力，且miR-30a的低表达与乳腺癌的预后成负相关。Zhu等［8］的研究表明在乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF-7中，miR-30a可以负向调节beclin-1的mRNA和蛋白的表达。通过与beclin-1作用，miR-30a可以减少beclin-1介导的细胞自噬，从而抑制肿瘤的发生发展。除此之外，miR-30b在治疗方面也有一定的作用。Ichikawa等［9］研究发现，经过曲妥珠单抗的处理，表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)阳性的乳腺癌细胞系SKBR3和BT474中，miR-30b的表达上调。并且miR-30b可以抑制乳腺癌细胞的生长，使细胞周期停止在G1期，并且他们找到了相关的靶基因细胞周期蛋白E2(cyclin E2，CCNE2)。Wu 等［10］发现，在乳腺癌手术切除标本中，Ubc9的表达增加;结合生物信息学的方法验证了miR-30e可以抑制Ubc9的表达;在乳腺肿瘤标本中miR-30e的表达下降，而外源性的miR-30e可以抑制细胞的生长。

三、肺癌

Kumarswamy等［11］发现在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中E-cadherin和miR-30a表达呈正相关。具有侵袭性和转移性的肺癌细胞系转染miR-30a后，细胞形态发生改变，伴随Snai1的表达下降和E-cadherin的表达升高。应用鸡胚转移检测方法发现miR-30a抑制体内水平的肺转移和肝转移。并且miR-30a在大部分检测的NSCLC标本中表达下降。结合生物信息学和萤光素酶载体等方法证实Snai1可能是miR-30a的靶基因。miR-30a在判断预后方面也有一定的作用，Hu等［12］对30个生存时间较长的患者和30个生存时间较短的患者血清进行了检测，发现了四种差异表达的miRNA，分别为miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499。其中miR-30d高表达的患者生存时间较短。Garofalo等［13］对miRNAs在耐药性方面的作用进行了研究。他们发现在NSCLC中，由EGFR和MET受体介导的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)抵抗的过程中，miR-30b、miR-30c、miR-221和 miR-222的表达增加，诱导 NSCLC对TKIs的耐药性增加，结合生物信息学和萤光素酶载体等方法证实BIM(BCL2-like 11)和APAF-1(apoptotic peptidase activating factor 1)可能是相关的靶基因。Wu等［10］发现，在肺癌组织中，Ubc9的表达增加，利用生物信息学和萤光素酶载体等方法验证了miR-30e可以抑制Ubc9的表达，进一步检测发现肿瘤标本中miR-30e的表达下降，而外源性的miR-30e可以抑制细胞的生长，从而发挥类似于抑癌因子的作用。

四、消化系统肿瘤

除了卵巢癌和乳腺癌之外，Li等［6］发现miR-30d在结肠癌细胞系HCT116中表达上调;miR-30d可以促进癌细胞的生长;抑制miR-30d可以观察到细胞周期明显停滞在G0/G1期;细胞产生典型的衰老形态;miR-30可以减少caspase-3的表达，抑制癌细胞的凋亡;体内实验表明抑制miR-30d可以抑制肿瘤的生长。所以caspase-3可能是其靶基因。Mosakhani等［14］的研究发现，在含有野生型 KRAS和 BRAF基因的抗EGFR难治性转移性结直肠癌患者中，miR-30b和miR-30c与结肠癌的预后呈负相关。在生存时间较短的患者标本中，miR-30b和miR-30c的表达增加，提示了miR-30b和miR-30c在判断预后中的作用。长期幽门螺杆菌的感染可以导致胃癌的发生［26］。最近的一篇文章报道了miR-30b在促进幽门螺杆菌生长方面的作用。Tang等［19］发现miR-30b可以与其靶基因ATG12和BECN1作用，抑制细胞的自噬作用，使得细胞内的幽门螺杆菌可以逃避自噬对它的清除，使幽门螺杆菌的感染持续存在，最终可能导致胃癌的发生。Joglekar［20］等发现miR-30族可以通过抑制Vimentin和Snail1的转录从而抑制胰腺上皮细胞EMT过程。

五、黑色素瘤

Gaziel-Sovran等［15］报道了miR-30b和30 d在黑色素瘤中的作用。他们发现miR-30b和30 d与肿瘤的分期、转移、复发时间和存活时间有关。通过抑制其靶基因N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)还原酶GALNT7的表达促进了黑色素瘤细胞的转移能力、增加了IL-10的表达从而导致免疫细胞的失活，起到了免疫抑制的作用。miR-30还可以通过促进细胞的衰老来抑制肿瘤的发生。

六、宫颈癌、卵巢癌

Martinez等［16］发现在HeLa细胞系中，由视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)诱导的细胞衰老可以促进miR-30族的表达。进一步分析发现miR-30可以与其可能的靶基因BMyb作用，抑制细胞的增殖，促进细胞的衰老以及抑制DNA的合成。Bridge等［17］发现了miR-30在血管增殖方面的作用。在卵巢细胞系LEC中miR-30b可以导致体外模型中血管数量和长度增加。DLL4(Delta-like 4)属于Notch家族的一个细胞膜结合的配体，在血管发展和生成中起着重要的作用。miR-30b和miR-30c可以与DLL4作用，增加血管的生成。Kumar等［18］发现miR-30d可以抑制TP53基因，从而下调p53蛋白的表达。因此，miR-30d可以抑制细胞的凋亡，抑制细胞周期停止和细胞的衰老，从而促进肿瘤的发生。

七、其他肿瘤

Quintavalle等［21］研究发现了 miR-30b和 miR-30c在脑胶质瘤中的作用。在对抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导的配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)中，miR-30b和miR-30c的表达上调，经过验证miR-30b和miR-30c作用其靶基因caspase-3发挥TRAIL抵抗的功能，并且这种作用在肺癌细胞中也有体现。Chang等［22］的实验证实miR-30e和miR-30c受到Myc调节。Myc可以与它们的启动子结合，抑制miR-30e和miR-30c的表达，从而促进肿瘤尤其是淋巴瘤的发生。Wszolek等［23］筛选了在侵袭性和非侵袭性膀胱尿道上皮癌(urothelial carcinoma of the bladder，UCB)中差异表达的 miRNAs。发现在非侵袭性的UCB中，miR-200c、miR-141和miR-30b显著减少，应用这三个miRNAs来进行对 UCB的诊断，其敏感性可以达到100%，特异性达到96．2%。在鼻咽癌中，miR-30e联合其他四个miRNAs同样具有判断预后的作用。并且miR-30e与鼻咽癌的无疾病生存(disease free survival，DFS)成正相关［24］。Braun等［25］研究了 miR-30 在甲状腺癌中(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)的作用。发现miR-30d和miR-30e在ATC中表达显著减少。通过分析miR-30d和miR-30e可以导致ATC细胞形态的改变以及波形蛋白(vimentin)表达下降;抑制miR-30d和miR-30e可以促使ZEB表达增加，促进EMT的过程;miR-30d和miR-30e可以抑制ATC细胞的体外侵袭能力;并且miR-30d和miR-30e可以抑制肿瘤坏死因子β受体 1(tumor-necrosis factorβ，TGFBR1)和 SMAD2的表达。

综上所述，miR-30通过对靶基因的调控，从而调节细胞的分化、增殖和凋亡，参与肿瘤细胞的侵袭、血管浸润和转移。随着对microRNA功能和作用机制研究的不断深入，人们发现microRNA与其所调控的靶基因之间存在复杂的调控网络，一个microRNA分子可能调控多个基因的表达，一个基因也可能接受多个microRNA分子的调控。而microRNA自身的表达也受多种机制的调控，在细胞内，microRNA既可通过调控相关基因的表达调控细胞内的信号传导，同时其自身的表达也受细胞内某些信号传导通路的调控，可能形成一个封闭的细胞内信号调控环路。深入研究microRNA相关的细胞内信号传导的调控网络，将有助于进一步揭示肿瘤的发生和发展机制，为肿瘤的治疗提供新的视角。由于microRNA可同时调控多个基因，其在细胞生物学中的意义显得尤为突出，miR-30族是近年来新发现的一类microRNA，目前发现其可以靶向的肿瘤相关基因有:Galphai2、ITGB3、Smad2、TGFBR1、p53［27-28］、B-myb、DLL4、Snail 1、MYCN［29］。miR-30不仅调控肿瘤的生长和转移，而且可能在肿瘤血管生成和肿瘤干细胞中也具有重要作用，因此随着研究的不断深入，miR-30可能会成为肿瘤临床治疗的一个潜在手段。

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