生物芯片检验技术在医学诊断中的应用

【作者】张志军，许伟

国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心，北京市，100044

医学诊断通常需要多个个体样品和每个样品的多指标同时检验，但目前的生化检验，多为单样品、单指标，存在需要样品量大和检验时间长的问题。探索高通量检验技术是医学诊断的热点研究领域。生物芯片技术是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子进行准确、快速、高能量检测的技术。这一技术的发展可起源于一个多世纪前，当时Ed.Southern建立了以其名字命名的Southern印迹技术，这被人们视为人类第一个“生物芯片”。此后，20世纪80年代初杂交测序概念的提出，W.Bains等人借助杂交方式对固定到支持物上的小DNA片段进行序列测定的工作都为生物芯片的发展奠定了基础；之后为适应“后基因时代”的到来，90年代，生物科学技术产生了以基因芯片为先导的生物芯片技术[1]，这使得生物芯片技术进入了一个全新的技术时代。目前生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室、细胞芯片、组织芯片、糖芯片、电子芯片、流过式芯片、三维芯片、光纤芯片和聚毗咯膜芯片等[2-3]多种生物芯片技术。

1 基因芯片

基因芯片是生物芯片技术中发展最成熟且最先进入应用和实现商品化的技术，它的两个主要分支技术——寡核苷酸芯片技术与DNA微阵列技术分别于20世纪90年代先后问世。这一技术在短短十多年的发展进程中不仅加速了生物科学的发展同时自身也得到了飞速提高。这一技术是基于核酸互补杂交原理研制而成的一种使待分析样品通过与芯片中已知碱基顺序的DNA片段互补杂交，从而确定样品中的核酸序列和性质，并对基因表达的量及其特性进行分析的技术。基因芯片根据功能的不同可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片，根据基因芯片所用基因探针的不同可分为cDNA微阵列芯片和寡核苷酸阵列芯片两类，根据固相支持物的不同可分为无机（玻璃、硅片等）芯片与有机（聚丙烯膜、硝酸纤维素膜等）芯片，根据点样方式不同可分为原位合成芯片、微矩阵芯片（分喷点和针点）和电定位芯片，根据应用领域的不同又可将其分为各种专用型芯片，如表达谱芯片、病毒芯片等。

基因芯片技术革新主要包括芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应及信号的检测与分析这4个环节。基因芯片的优点主要体现在快速准确、微型化、自动化、多功能这四个方面[4]。该技术主要应用于基因差异表达分析和基因鉴定，DNA测序、基因突变及多态性扫描，肿瘤的发生、分型与诊断，基因组的比较及细菌学、病毒学等的多项研究中。

2 蛋白芯片

20世纪80年代，Ekin和Chu为检测多种蛋白的表达首先提出了以抗体为基础的“微阵列”概念，并证实了基于抗体微阵列的技术可以同时高度敏感的检测多种蛋白质。1994年澳大利亚Wilkin和Williams提出了“蛋白质组”的概念，它与90年代中期发展起来的生物芯片相结合后即产生了新的生物研究技术——蛋白质芯片技术。这一技术虽只有十多年的发展历程，但其已在蛋白质间相互作用、蛋白质与小分子相互作用等多个研究领域发挥出了巨大的作用。蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，它是将大量的蛋白质、蛋白质检测试剂或检测探针以预先设计的方式固定在玻片、硅片及纤维膜等固定载体上组成密集的阵列，能够高通量地测定蛋白质的生物活性，蛋白质与大分子和小分子的相互作用，或者用于高通量定性和定量检测蛋白质[5]。它与基因芯片的不同之处在于芯片上固定的分子是蛋白质抗原/蛋白质抗体，其检测原理是蛋白质分子之间、蛋白质与核酸、蛋白质与其他分子的相互作用[10]。

目前对蛋白质芯片的分类可根据结合反应的不同将其分为化学芯片与生物芯片[6]。化学型蛋白质芯片的构想来源于经典色谱法（反相层析、离子交换层析、金属螯合层析等）。铺有相关介质的蛋白质芯片可以通过介质的疏水力、静电力、共价键等结合样品中的蛋白质，用洗脱液去除杂质蛋白质，而保留感兴趣的蛋白质。生物型蛋白质芯片则是将生物活性分子（如：抗体、抗原、受体或配体等）结合到芯片表面，用于捕获靶蛋白。根据载体的不同[7-8]，将蛋白质芯片分为普通玻璃载体芯片、多孔凝胶覆盖芯片及微孔芯片。此外还可根据用途不同将其分为蛋白质功能芯片与蛋白质检测芯片[9]。

蛋白质芯片制备与检测主要包括载体的选择及抗体或抗原的固化，抗原或抗体的标记，封闭，探针蛋白的制备，抗原抗体的反应，蛋白质芯片的检测等几个方面。蛋白质芯片技术与传统的蛋白质研究方法相比具有以下优点：高通量，这一技术能在一次实验中提供相当大的信息量，使研究者能全面准确的研究蛋白质表达谱；高灵敏度，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在，检测水平可达ng水平；Angelika Lueking等[10]用人类苷油醛-3-磷酸盐脱氢酶，人类热休克蛋白片段和鼠免疫球蛋白重链结合蛋白抗体制作成抗体陈列，其灵敏度的可检测下限为10 fm/mL，而Haab[11]的试验则可将检测下限达到1 ng/mL的水平，并有较高准确性[12]。

蛋白质芯片技术的起步虽然较晚但其发展应用的领域广，目前这一技术主要应用于蛋白差异表达分析、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰、蛋白质-DNA相互作用、小分子-蛋白质间相互作用、抗体检测、碳水化合物检测、疾病诊断等多个方面。

3 芯片实验室

芯片实验室是将样品制备、生化反应及检测分析等过程集约化形成的微型分析系统。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片[13]。虽然由于技术上的难题，以及应用过程中的复杂性和市场接受程度的限制，使这一技术在进行应用阶段还存在相当困难，但这可以认为是生物芯片技术发展的最终目标。

4 组织芯片

组织芯片也称组织微阵列。这一概念于1998年由Kononen等提出，它可以看成是基因芯片技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白质（抗体）芯片一样属于一种特殊形式的生物芯片技术。这一技术是将成百上千个不同个体的组织标本按预先设计或研究需要排列在一张固相载体（载玻片）上所形成的组织微阵列，是一种高通量、多样本的分析工具[14]。

5 细胞芯片

细胞芯片又称细胞微阵列，是2001年由美国麻省理工学院的Zlauddin和Sabatinl等人发明的一种高通量的基因反向转染技术[15]。其原理是首先将不同的DNA探针点在玻璃片上，做成DNA微阵列芯片，接着用脂质体转染方法处理该DNA微阵列芯片，然后在脂质体处理的DNA微阵列上培养哺乳动物细胞，点在芯片上的DNA在转染试剂的作用下原位转染哺乳动物细胞，在DNA微阵列的每一个DNA样品点的相同位置形成了转染该DNA的细胞集群，细胞因获得了外源DNA 而获得新的表型[16]。这一技术可用于药物的高通量筛选和功能验证，确证药物作用靶点，寻找能改变细胞生理状态的基因产物等研究领域[17]。

6 糖芯片

糖芯片又称糖微阵列，是一种用于糖组学研究的新兴工具，根据芯片上糖的特征可分为单糖芯片、寡糖芯片、多糖芯片和复合糖芯片；根据用途可分为功能糖组学糖芯片和药物糖芯片。这一芯片技术可同时分析空前数量的多糖—蛋白质相互作用，可用于功能糖组学、药物筛选、抗体结合特异性分析、细胞黏附检测和酶测定及药物糖组学等方面的研究[1]。

我国已有360余项芯片技术和检验技术的发明专利，其中检验部分主要为医学检验和诊断。表明我国在生物芯片的研究和应用中已经具有初步的技术基础。但从技术基础和水平上来看，我国在生物芯片的技术研究上水平还较低，生物芯片高通量这一技术特点尚未从根本上突破，与国外全基因芯片和极高通量的微珠芯片相比，我国的芯片同时检测的样品数通常低于20个，而各样品检验的指标一般不超过10个。事实上芯片技术迅速发展，美国、德国及瑞典等国家的高技术公司在不同种类和不同技术原理各类芯片上已有了突破性的进步，发展成如微流芯片和微珠芯片等技术上更为先进的芯片技术，而且已开始市场应用。这些新技术的检验准确性、通量、感应器和指标间干扰等均比传统的微阵列芯片有了飞跃性发展。因此我国的研究机构和高技术医学技术公司应高度重视生物芯片技术的研究，发展我国的准确、简便、低成本和微小生物样本量的高通量医学诊断和检验。

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