窝儿七中化学成分活性的研究

杨秀芳， 马养民， 郑敬海， 刘建军， 康永祥

(1.陕西科技大学 化学与化工学院 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室， 陕西 西安 710021； 2.西北农林科技大学 林学院， 陕西 杨凌 712100)

0 引言

窝儿七是小檗科(Berberidaceae)鬼臼亚科(Podophylloideae)山荷叶属(Diphylleia)的中华山荷叶(DiphylleiasinensisLi.)，是我国特有植物，分布于陕西、甘肃、四川、湖北等地.其根茎和须根可供药，根茎能消热、凉血、活血、止痛，并具有泻下作用.主治腰腿疼痛、风湿性关节炎、骨蒸痨热、跌打损伤、月经不调等症.须根能清热败毒、破血祛瘀、凉血，多用于妇科病[1].窝儿七的化学成分以木脂素类化合物为主，该类化合物主要应用于抗肿瘤、治疣等[2,3].2001年，谭苹等对40种秦岭“七药”最低抑菌浓度进行测试，将测试“七药”制成生药原液，以不同的稀释度与11种标准菌种共同培养， 观察其抑菌作用，以传统抗菌中药黄连作为对照组.实验结果表明，窝儿七药液的抑菌作用明显优于黄连[4].为了进一步研究窝儿七化学成分的活性作用，本文首次对从窝儿七分离纯化得到的化合物的抑菌活性和镇痛活性进行了研究，期望从中获得抑菌活性或镇痛作用好的化合物，为进一步开发利用窝儿七提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

从窝儿七中分离纯化得到的山奈酚，山奈酚糖苷，鬼臼毒素，鬼臼毒素糖苷，鬼臼毒酮，山荷叶素及山荷叶素糖苷[5].

1.1.2 供试菌种

细菌4株：大肠杆菌(Esherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)；

真菌4株：苹果腐烂病菌(Valsamali)、芍药炭疽病菌(C.gloeosporioides)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum).

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯(去皮)200.0 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL.

NA培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6.121 ℃灭菌20 min.

1.1.4 动物

雄性昆明种小鼠，18～22 g，由第四军医大学实验动物房提供(合格证号：SCXK(军)2007-007).

1.2 仪器

SW-CJ-1FD超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、YX280B手提式压力蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)、101-1型干燥箱(上海市实验仪器总厂)、DH5000B电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、HZQ-Q全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)、MK3型酶标仪(Thermo电(上海)仪器有限公司、BS224S分析天平(格瑞恩科技发展有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 菌液制备

将在固体培养基上培养的大肠杆菌(E.c)、绿脓杆菌(P.a)、金黄色葡萄球菌(S.a)、枯草芽孢杆菌(B.s)、苹果腐烂病菌(V.m)、芍药炭疽病菌(C.g)、烟草赤星病菌(A.a)、小麦赤霉病菌(F.g)从恒温培养箱中取出，在灭菌后的超净工作台上将以上各菌接种至配制好的液体培养基中，再将接菌后的液体培养基转移至全温振荡器，温度恒定在28 ℃培养48 h，备用.

1.3.2 试样制备方法

将从窝儿七中分离纯化得到的山奈酚、山奈酚糖苷、鬼臼毒素、鬼臼毒素糖苷、鬼臼毒酮、山荷叶素及山荷叶素糖苷，分别称取0.2 mg，用2 mL二甲基亚砜溶解，备用.

鬼臼毒素水溶液：将窝儿七中分离得到的鬼臼毒素样品用蒸馏水配制成5组鬼臼毒素水溶液，浓度分别为1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg，每组10 mL,备用.

1.3.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

(1)取紫外消毒的96孔板，竖排依次编号A、B、C、D、E、F、G、H、I，横排依次编号1、2、3、4、5、6、7、8(编号为A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6、 A7、A8，B1-B8……H1-H8，I1-I8).选取一种稀释过的菌悬液，在灭菌后的超净工作台上，用移液枪吸取100μL菌悬液放置在板孔中，重复此操作，在编号的孔板注入100μL菌悬液.

(2)在灭菌后的超净工作台上，取配制好的待测鬼臼毒素样品，用移液枪吸取100μL注入在已有菌悬液的A1孔中、混匀.待菌悬液与鬼臼毒素样品混匀后，再用移液枪从A1孔中吸取混合液体100μL，注入A2孔中，依次进行倍半稀释，将A1-A8孔分别注入鬼臼毒素样品.最后，从A8孔中吸取出100μL混合溶液，弃掉.经过此步操作A1-A8孔中均剩余100μL混合溶液，鬼臼毒素样品浓度依次为50，25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.75，0.38μg/mL.

(3)按照步骤(2)的操作，将B1-B8注入山荷叶素糖苷，C1-C8注入山奈酚，D1-D8注入山奈酚糖苷，E1-E8注入鬼臼毒酮，F1-F8注入山荷叶素，G1-G8注入鬼臼毒糖苷，H1-H8注入对照样品，细菌对照样品为青霉素钠、硫酸链霉素，真菌对照样品为酮康唑，I1-I8为空白对照.

(4)再取96孔板，按照步骤(1)至(3)把各个测试菌与各个测试样品混合，完成后，将注入待测样品与菌悬液的96孔板放入电热恒温培养箱中，温度恒定在28 ℃培养24 h.用酶标仪测各个板孔的透光度，再由透光度来计算各个样品的抑制率[6].

式中：P─控制率；K0─溶剂对照孔；K1─样品孔；K2─空白对照孔.

1.3.4 镇痛活性测定(热板法)

取雄性昆明小鼠35只，随机分成7组.其中一组皮下注射生理盐水，作为空白对照；一组皮下注射30 mg/kg阿司匹林水溶液，作为对照组；其余5组编号为鬼臼毒素a、b、c、d、e，分别皮下注射不同浓度的鬼臼毒素水溶液(给药量为100 mg/kg、30 mg/kg、10 mg/kg、3 mg/kg、1 mg/kg)，每只小鼠注射量为0.2 mL.将注射药品的小鼠尾部浸入50 ℃的热水中，记录其甩尾时间[7]，通过公式计算小鼠痛阈提高率：

式中：P─痛阈提高率；T─给药后小鼠甩尾时间；T0─给药前小鼠甩尾时间.

2 实验结果

2.1 化合物的抑菌活性

窝儿七中分离纯化得到的山荷叶素(Ⅰ)、山荷叶素糖苷(Ⅱ)、山奈酚(Ⅲ)、山奈酚糖苷(Ⅳ)、鬼臼毒酮(Ⅴ)、鬼臼毒素(Ⅵ)及鬼臼毒素糖苷(Ⅶ)的MIC测试结果可以看出，各个化合物对测试的8种菌均有良好的抑制作用.表1为各样品对测试细菌的MIC，从表中可以看出，山荷叶素、山荷叶素糖苷、山奈酚、山奈酚糖苷、鬼臼毒酮对于大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC均不大于25μg/mL；鬼臼毒素与鬼臼毒素糖苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC为12.5μg/mL，对于绿脓杆菌抑制作用最好，MIC为6.25μg/mL.表2为各样品对测试真菌的MIC，由表看出山荷叶素、山荷叶素糖苷、对于苹果腐烂病菌、芍药炭疽病菌、烟草赤星病菌、小麦赤霉病菌的MIC均为25μg/mL；山奈酚、山奈酚糖苷对于芍药炭疽病菌、烟草赤星病菌、小麦赤霉病菌的MIC为12.5μg/mL；鬼臼毒素与鬼臼毒素糖苷对苹果腐烂病菌的MIC为12.5μg/mL，对芍药炭疽病菌、烟草赤星病菌与小麦赤霉病菌的MIC为6.25μg/mL；鬼臼毒酮对苹果腐烂病菌、小麦赤霉病菌的MIC为12.5μg/mL，对芍药炭疽病菌、烟草赤星病菌的MIC为6.25μg/mL.结果表明鬼臼毒素类化合物对真菌有良好的抑制作用.

表1 不同化合物对细菌最小抑菌浓度

其中Ⅷ：青霉素钠，Ⅸ：硫酸链霉素.

表2 不同化合物对真菌最小抑菌浓度

其中Ⅹ：酮康唑.

2.2 鬼臼毒素的镇痛活性

通过热板法，按照1.2.4，测试不同浓度鬼臼毒素对小鼠痛阈值提高率随时间变化的影响，研究鬼臼毒素的镇痛活性，结果如图1所示.

图1 不同剂量的鬼臼毒素 镇痛提高率随时间的变化

从图1中可看出鬼臼毒素对小鼠的镇痛提高率与剂量呈依赖性，在浓度为1～100 mg/kg范围内，镇痛效果随剂量的增大而增大；同时随时间的变化趋势是镇痛提高率先增大后减小，注射鬼臼毒素后15 min达最大.

图2 鬼臼毒素与阿司 匹林镇痛效果对比

图2为同等剂量(30mg/kg)的鬼臼毒素与阿司匹林对小鼠镇痛效果的比较，从图2看出，当浓度一定时，鬼臼毒素的镇痛效果比阿司匹林的镇痛效果明显.但镇痛作用时间与阿司匹林相比，持续时间短.

3 结束语

(1)窝儿七中含有丰富的具有生物活性的物质.分离纯化得到的系列化合物(山奈酚，山奈酚糖苷，鬼臼毒素，鬼臼毒素糖苷，鬼臼毒酮)对细菌和真菌均有很好的抗菌活性；山荷叶素及山荷叶素糖苷对于细菌和真菌的抗菌活性相比之下稍差.其中鬼臼毒素及鬼臼毒素糖苷的抑菌作用最为显著.

(2)窝儿七中分离纯化得到的鬼臼毒素有一定的镇痛作用，与阿司匹林相比，鬼臼毒素镇痛作用见效快，但镇痛作用时间短.

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