原发性高血压条件下骨髓来源内皮祖细胞数量及功能的变化

陆庆明 邸春霞 张荣庆 王海昌

1.解放军总医院南楼外一科，北京 100853；2.解放军第三〇九医院心内科，北京 100094；3.第四军医大学西京医院心内科，陕西西安 710032

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞，即具有向成熟内皮细胞分化的潜能，EPC 主要存在于骨髓、外周血、脐血等，在胚胎期参与胚胎血管生成，出生后的参与血管新生过程，其数量及功能变化直接影响到心血管系统的自我修复能力[1]。而且近年来的研究发现，EPC 可以作为内皮损伤的标志物，EPC 数量减少可以作为心血管事件独立的危险因素[2]。本研究拟在探讨高血压条件下EPC 数量及功能的变化，为阐明原发性高血压及其血管并发症发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组

将12只雄性自发性高血压大鼠（SHR）分为6周龄组和12周龄组，每组各6只，以同周龄正常雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（10只）分别为对照组，每组各 5只，均购自第四军医大学动物实验中心，以RBP-1B型大鼠血压计（中日友好临床医学研究所）连续测压3次大鼠尾动脉收缩压取均值。

1.2 主要试剂

VEGF（Biovision 公司），M199 培养基（Gibco公司），b-FGF（Peprotech 公司），胎牛血清（Hyclone 公司），FITC-UEA-1（Sigma 公司），Dil-ac-LDL（Invitrogen 公司），NO 检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。

1.3 EPC的分离与培养

颈椎脱臼法处死实验大鼠，取双侧股骨、胫骨、肱骨，去除两端软骨后以完全培养液反复冲洗骨髓腔，将得到的骨髓细胞悬液与淋巴细胞分离液以1∶1 比例混合后采用密度梯度离心法获取单个核细胞，将单个核细胞接种于M199培养基（M199，VEGF 10 μg/L，bFGF 5 μg/L，10%FBS，L-谷氨酰胺 300 mg/L，青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL），4 h后翻转培养瓶去除贴壁细胞，未贴壁细胞继续培养促其二次贴壁，继续培养7d后消化收集二次贴壁细胞接种于96 孔板中，将得到的细胞进行细胞化学分析。

1.4 细胞染色鉴定

细胞与 Dil-ac-LDL（10 μg/mL）在 37℃避光孵育 10 h，中性甲醛（2%）固定10 min，以PBS 液漂洗后加入FITCUEA-1（10 μg/mL），避光孵育 1 h。用多波长激光共聚焦显微镜观察Dil-ac-LDL 与FITC-UEA-1 双染阳性细胞被认为是正在分化的EPC。随机选择15 孔并在倒置荧光显微镜下（200倍视野）计数EPC。

1.5 EPC 增殖能力检测

7d后消化收集二次贴壁细胞以1.0 ×104 细胞/孔的密度接种于96 孔板中，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，继续孵育4 h，每孔加入二甲基亚砜150 μL。微量震荡器充分震荡10 min后，在酶联免疫检测仪测吸光度值（波长 490 nm）。

1.6 NO分泌能力检测

消化培养7d的细胞，离心后加入完全培养液重悬，将细胞接种于96 孔板，接种密度为1.0 ×104 细胞/孔。将孔内培养液上清收集后用硝酸还原酶法测定检测各孔上清和浓度之和从而间接反映NO 含量。

1.7 凋亡检测

消化培养7d的细胞，离心后加入完全培养液重悬，以1 000 r/min 离心5 min后弃上清，流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

1.8 统计学方法

采用SPSS 10.0 软件进行方差齐性检验，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，比较采用成组t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血压

SHR 6周龄组平均血压124.5～126.0 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），WKY 6 周龄组平均血压 114.8～116.5 mm Hg（P ＜0.05）；SHR 12 周龄组平均血压 140.5～146.0 mm Hg，WKY 12周龄组平均血压 117.8～120.4 mm Hg（P＜0.01）。

2.2 EPC的分离与鉴定

镜下观察分离得到的单个核细胞经过7d 诱导分化为梭形或多角形的内皮样细胞，多波长激光共聚焦显微镜下以双染法（Dil-ac-LDL 与 FITC-UEA-1）鉴定培养细胞，Dil-ac-LDL 染色阳性细胞在显微镜下激发出红色荧光，而FITC-UEA-1 染色阳性细胞呈绿色荧光，而双染阳性细胞即为正在分化的EPC 细胞。培养细胞计数结果：SHR 6周龄组 EPC 数量[（38.7±4.3）个/视野（×200）]与对照组[（44.7±5.2）个/视野（×200）]相比差异无统计学意义（P＞0.05）。SHR 12周龄组 EPC 数量与对照组相比[（10.7±1.6）和（49.1±9.2）个EPC/视野（×200）]明显减少（P＜0.01）。

2.3 原发性高血压对EPC 增殖能力的影响

与对照组相比，SHR 6周龄组EPC 增殖能力略低 [吸光度值（0.174±0.009）和（0.213±0.012）]（P＜0.05）；SHR 12周龄组EPC 增殖能力较对照组明显降低 [吸光度值（0.121±0.006）和（0.209±0.022）]（P＜0.05）。

2.4 原发性高血压对EPC NO分泌的影响

SHR 6周龄组NO分泌较WKY 6周龄组减少 [（44.6±5.3）μmol/L 和（56.3 ±4.5）μmol/L]，（P＜0.05），SHR 12 周龄组NO分泌与对照组相比显著下降[（37.5±1.4）μmol/L 和对照组（50.6±2.3）μmol/L]（P＜0.01）。

2.5 原发性高血压对EPC 凋亡的影响

SHR 6周龄组EPC 凋亡率与WKY 6周龄组相比差异无统计学意义 [（13.3±2.0）%和（11.7±0.2）%]（P＞0.05），SHR 12周龄组EPC 凋亡率与对照组相比显著增加[（34.5±2.1）%和（10.7±0.4）%]（P＜0.01）。

3 讨论

高血压并发症主要为心、脑、肾、大血管及眼底病变，其原因可分为“血压升高因素”和“动脉粥样硬化因素”。前者可通过降低血压水平而有效预防，而高血压作为动脉粥样硬化最重要的独立危险因素，降低血压本身不能阻止动脉粥样硬化的进程，血压升高引起的内皮细胞损害在其中起了重要的作用，启动动脉粥样硬化一系列反应链。最初人们认为当血管内皮损伤后，临近损伤部位的健康内皮细胞迁移、增殖是主要的修复途径。有学者从人外周血发现循环内皮祖细胞，并在动物模型中发现EPC 能分化为成熟内皮细胞[3]，后来的研究者在外周血、脾脏、骨髓、脐血中都分离出了EPC，并证实了EPC 有很高的增殖能力且能在VEGF、SDF-1等趋化因子的作用下归巢到缺血组织参与新生血管形成[4]。EPC 在治疗动脉粥样硬化性疾病和外周血管病的巨大的潜力使其成为近年来研究的热点。

既往对EPC 活性及分布的研究表明，EPC 在胚胎期分布在配外中胚层卵黄囊血岛，在成年个体中，EPC 在骨髓来源的单个核细胞中约占3%，在外周血单个核细胞中约占0.2%。心血管危险因素与外周血EPC的数量、迁移功能呈显著负相关[5]，国内研究证实了患有冠心病的患者外周血EPC的数量减少，功能减退[6]。但上述研究均是抽取冠心病患者外周血，分离EPC 计数并检测其功能，关于高血压患者与EPC的研究较少，高血压患者其骨髓来源EPC的数量和功能变化如何仍未有定论。

本研究的结果提示在高血压条件下，骨髓来源EPC的数量减少，在SHR 6周龄组与对照组相比这种差异不明显（P＞0.05），但随着血压增高及高血压病程的延长，骨髓来源EPC 数量显著减少（P＜0.01）。SHR 6周龄组骨髓来源EPC 与对照组比较增殖能力、NO分泌能力均减退（均P＜0.05），细胞凋亡与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；12周龄SHR 骨髓来源EPC 与对照组比较EPC 增殖能力、NO分泌功能均明显受损（均P＜0.01），细胞凋亡增多（P＜0.05）。说明随着高血压病程的发展骨髓来源EPC 功能逐渐受到损害，凋亡增多。

综上所述，本研究证实了高血压条件下骨髓来源EPC数量减少，功能减退，凋亡增多，且随着血压升高和高血压病程的发展，高血压对EPC的损害逐渐加重。为解释高血压血管并发症的发生机制提供了实验依据，为进一步了解EPC的生物活性和调节机制打下基础。

[1]Werner N，Nickenig G.Clinical and therapeutical implication of EPC biology in atherosclerosis[J].J Cell Mol Med，2006，10（2）：318-332.

[2]Hill JM，Zalos G，Halcox JP，et al.Circulating endothelial p rogenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk [J].N Engl J Med，2003，348（7）： 593-600.

[3]Gensch C，Clever YP，Werner C，et al.The PPAR-gamma agonist pioglitazone increases neoangiogenesis and prevents apoptosis of endothelial progenitor cells.Atherosclerosis，2006，（192）：67-74.

[4]Shirota T，He H，Yasui H，et al．Human endothdial progenitor cel1-seeded hybrid graft：proliferative and antithrombogenic potentials in vitro and fabrication processing[J].Tissue Eng，2003，9（1）：127-136.

[5]Vasa M，Fichtlscherer S，Aicher A，et al.Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease[J].Circ Res，2001，89（1）：1-7.

[6]刘燕荣，陈君柱，王兴祥，等.冠心病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的变化[J].临床心血管病杂志，2004，3（20）：145-147.