一株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌MJ0301培养基的优化

黄桂东，毛 健,,*，姬中伟，傅健伟，邹慧君

(1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.国家黄酒工程技术研究中心，浙江 绍兴 312000)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质[1]，具有降血压[2]、改善脑部血液循环[3]、治疗癫痫[4]、控制哮喘[5]、精神安定[6]等生理活性。GABA既是一种具有显著药理作用的药物，又被视为具有保健功能的新型功能性因子，在食品、医药等领域具有十分乐观的应用前景[7]，因此，GABA的合成已引起了人们的广泛关注和重视。

GABA虽然在动植物体内均分布广泛[8-9]，但其天然存在量低，从天然组织中分离提取难度较大[10]。目前获得GABA的方法主要是化学合成法和生物法两类，其中生物法包括植物富集法和微生物发酵法[11-12]。化学合成法反应速度快、得率高，但反应条件苛刻，且有化学物质残留，脱除产品中有毒成分比较复杂、成本高、安全性差，其在食品加工中的应用受到了限制[11]。虽然GABA的植物富集法制备工艺比较简单，但GABA得率较低，不适于大规模生产GABA[10]。微生物发酵法的早期研究是以大肠杆菌作为生产菌进行的[13]。在发酵培养过程中，利用大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的脱羧作用，将L-谷氨酸转化为GABA，再进行分离纯化[14]。林少琴等[15]以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定化大肠杆菌谷氨酸丙酮粉生产GABA，虽然具有较好的热稳定性，但安全性较差。除大肠杆菌外，含有谷氨酸脱羧酶的酵母[16]、乳酸菌[17]等也可用于GABA的生产。近年来，乳酸菌被看作是一种食品安全级(generally regarded as safe，GRAS)的微生物，在食品工业中的应用非常广泛且历史悠久，乳酸菌在人和动植物体内定殖并产生大量有益健康的成分，被誉为重要的、必不可少的益生菌[18]。其生产的GABA更具有安全性且容易实现商业化生产，具有较好的应用前景。因此，本研究选用实验室保存的一株植物乳杆菌MJ0301，对其进行培养基成分优化，以提高其GABA产量。

1 材料与方法

1.1 菌种

黄酒发酵液中分离出的植物乳杆菌Lactobacillus plantarumMJ0301 本实验室保存。

1.2 培养基

MRS液体培养基[19]：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸三胺2g/L、K2HPO42g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温-80 1mL/L，调节pH值为6.2～6.4，121℃条件下灭菌20min。

斜面保藏培养基：同MRS液体培养基的配方，另加琼脂20g/L。

1.3 GABA的测定方法

采用氨基酸自动分析仪进行测定[20]。取1mL发酵液，加入4mL 10%的三氯乙酸(TCA)，振荡均匀后，静置30min，经双层滤纸过滤后，取1mL发酵液，于10000r/min离心10min，取0.5mL上清液于样品瓶中待用。经氨基酸自动分析仪分析，得出GABA产量。

1.4 生长曲线的绘制

取一环新鲜的斜面菌种，接种于装有100mL MRS发酵培养基的三角瓶中，于30℃恒温培养箱中静置培养24h，每隔2h取一次样品，以空白培养基为对照，在波长600nm处测定其吸光度，以培养时间为横坐标，A600nm值为纵坐标，绘制菌体的生长曲线。

1.5 培养基成分的单因素试验

考察培养基中碳源、氮源、底物质量浓度、吐温-80等因素对菌株GABA产量和生长情况的影响，确定最适宜的培养基成分。

分别选择20g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、丁二酸钠作为唯一碳源进行试验。在确定了碳源种类的基础上，以葡萄糖为唯一碳源，质量浓度分别为5、10、15、20、25g/L的MRS培养基，考察了葡萄糖质量浓度对乳酸菌生长及GABA产量的影响。

以MRS液体培养基为基础，分别采用10g/L的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、硫酸亚铁铵作为唯一氮源进行试验，考察不同氮源对乳酸菌生长及GABA产量的影响。在确定了氮源种类的基础上，分别以胰蛋白胨和牛肉膏、胰蛋白胨和酵母膏、胰蛋白胨和蛋白胨作为复合氮源，该复合氮源成分的质量比是1:1，其质量浓度为10g/L，考察其对乳酸菌生长及GABA产量的影响。

在确定了碳源及氮源种类及其添加量的基础上，考察K2HPO4质量浓度(1、1.5、2.0、2.5、3.0g/L)、吐温-80添加量(0.5、0.75、1、1.25、1.5、2mL/L)和底物L-谷氨酸钠质量浓度(0、5、15、20、25g/L)对乳酸菌生长及GABA产量的影响。

1.6 响应面分析法优化培养基

采用响应面分析方法(RSM)对培养基的组成进行了优化。根据以上单因素试验的结果选取3个主要因素(葡萄糖、复合氮源、L-谷氨酸钠)进行响应面试验设计，并用Design-Expert软件对试验数据进行回归分析。根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以葡萄糖、复合氮源、L-谷氨酸钠3个因素为自变量，以GABA产量为响应值，设计了三因素三水平的响应面分析试验，共有17个试验点。

2 结果与分析

2.1 菌株MJ0301的生长曲线及GABA初始生成量

图1 菌株MJ0301生长曲线图Fig.1 The growth curve of Lactobacillus plmltarum MJ0301

由图1可知，该菌的对数生长期是2～10h。菌株MJ0301的初始GABA生成量由氨基酸自动分析仪完成。菌株MJ0301发酵液的处理方法参照文献[17]进行。经测定后得出菌株MJ0301的初始GABA生成量为143mg/L。

2.2 培养基成分的单因素试验结果

2.2.1 碳源种类及其质量浓度的确定

2.2.1.1 不同碳源对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响

添加了20g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、丁二酸钠作为唯一碳源后，乳酸菌MJ0301的生长及GABA的产量如图2所示，碳源的种类对乳酸菌的生长及GABA的产量有较大的影响，以葡萄糖为碳源时，发酵液中的GABA产量为134.5mg/L，明显高于其他碳源，故选择葡萄糖为最佳碳源。

图2 不同碳源对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响Fig.2 Effect of carbon sources on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and yield of GABA

2.2.1.2 葡萄糖质量浓度对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响

进一步考察了葡萄糖质量浓度对乳酸菌生长及GABA产量的影响，不同葡萄糖质量浓度条件下，乳酸菌MJ0301的菌体生长量及GABA产量如图3所示，葡萄糖质量浓度对乳酸菌生长及GABA的产量有较大的影响。随着葡萄糖质量浓度的增大，发酵液中菌体含量增加，葡萄糖质量浓度增加至10g/L后，菌体数量基本无变化，但GABA产量有较大幅度的减少，分析这一现象的原因，可能是糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使pH值降低，引起菌体衰老。所以选择10g/L的葡萄糖作为最佳碳源质量浓度。

图3 不同葡萄糖质量浓度对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响Fig.3 Effect of glucose concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and yield of GABA

2.2.2 氮源的种类及其质量浓度的确定

2.2.2.1 不同氮源对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响

分别用10g/L的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、硫酸亚铁铵作为唯一氮源进行试验，考察了不同氮源对乳酸菌生长及GABA产量的影响，结果如图4所示，氮源的选取对于菌株MJ0301的菌体量及GABA的产量有很大的影响。当以无机氮源(硫酸亚铁铵)作为唯一氮源时几乎没有GABA生成，而且菌体量很低，说明该菌不能直接利用无机氮源；添加有机氮源作为唯一氮源时，菌体量都较高，其中又以胰蛋白胨为唯一氮源时，GABA产量最高。因此选择胰蛋白胨作为最佳氮源。

图4 不同氮源对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.2.2 复合氮源对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响

以胰蛋白胨和牛肉膏、胰蛋白胨和酵母膏、胰蛋白胨和蛋白胨作为复合氮源，考察其对乳酸菌生长及GABA生成量的影响，结果如图5所示，胰蛋白胨和酵母膏的质量比为1:1，质量浓度分别为10g/L时，GABA的产量明显高于另外两种组合。可能是因为酵母膏中含有丰富的氨基酸、核酸、维生素等物质，能够为菌体生长代谢提供所必需的生长因子。因此，本试验选择胰蛋白胨和酵母膏作为复合氮源。

图5 不同复合氮源对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响Fig.5 Effect of mixed nitrogen sources on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.3 K2HPO4对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响

一般情况下，微生物从无机磷化合物中获得磷，在体内同化为有机磷化合物，磷酸根在能量代谢中起着重要的调节作用，同时磷是构成磷酸和磷脂的主要组成成分，并参与构成许多酶的活性基团。钾虽然不参与细胞结构物质的组成，但能作为许多酶的激活剂，促进糖类代谢。从离子平衡角度来看，培养基中添加一定质量浓度的K2HPO4可以对乳酸菌培养体系中pH值变化起到了一定的缓冲作用。本实验考察了不同质量浓度K2HPO4对乳酸菌生长及GABA产量的影响，结果如图6所示，K2HPO4的质量浓度为2g/L时，GABA产量最高，故设置优化培养基中K2HPO4的质量浓度为2g/L。

图6 不同质量浓度的K2HPO4对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响Fig.6 Effect of K2HPO4 concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.4 吐温-80对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响

吐温-80是一种很好的乳化剂和分散剂，可以使培养基中的成分更加均匀，促进菌体的生长。本实验考察了不同体积分数的吐温-80对菌体生长及GABA产量的影响，结果如图7所示，吐温-80添加量在为1mL/L时，GABA的产量达到最大(对于之前锯齿状的实验数据可能是由于实验的操作误差导致，在经过重复实验后得到上述结果)。

图7 吐温-80添加量对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响Fig.7 Effect of Tween-80 concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.5L-谷氨酸钠对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响

谷氨酸质量浓度增大可使GABA支路中碳流量增加，并调节谷氨酸脱氢酶(glutamate decarboxylase，GAD)活性。L-谷氨酸钠质量浓度对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响如图8所示，L-谷氨酸钠质量浓度对菌株MJ0301产GABA有较大的影响。随着L-谷氨酸钠质量浓度的增大，GABA的产量也随之增加。当L-谷氨酸钠质量浓度超过20g/L后，菌体浓度基本保持不变，虽然GABA产量依然增加，但是从L-谷氨酸钠的转化率上是不断降低的。因此选择20g/L为L-谷氨酸钠的最优质量浓度。

图8 不同质量浓度的L-谷氨酸钠对菌株MJ0301生长及GABA产量的影响Fig.8 Effect of sodium L-glutamate concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.3 响应面试验结果与分析

由单因素试验结果可知，培养基中添加合适质量浓度的葡萄糖、胰蛋白胨和酵母膏对菌株MJ0301菌体生长及GABA生成均有显著促进作用。而培养基中K2HPO4和吐温-80的添加虽然对于乳酸菌的生长及GABA产量有一定的促进作用，但影响并不显著。因此，选择葡萄糖、复合氮源、L-谷氨酸钠进行三因素三水平的响应面试验。结果如表1所示。

表1 响应面试验设计方案及结果Table 1 Experimental design and results

对表1试验数据进行多项拟合回归，以GABA的产量为因变量，以碳源(葡萄糖)质量浓度、氮源(酵母膏、蛋白胨质量比为1:1)、L-谷氨酸钠质量浓度为自变量建立回归方程：

对回归方程进行方差分析，结果见表2。该方程表达了GABA产量与所选的3个因素之间的关系。回归方程的决定系数R2为0.9808。GABA与试验中3个因素的回归方程的F值为39.65，整体模型的P＜0.0001，表明方程模型极显著。葡萄糖质量浓度和L-谷氨酸钠质量浓度对GABA产量的影响极显著，氮源(胰蛋白胨与酵母膏复合氮源)影响不显著；交互项中，碳源和氮源，碳源和L-谷氨酸钠的交互影响极显著，氮源和L-谷氨酸钠的交互影响显著；二次项中，碳源、氮源和L-谷氨酸钠的影响极显著。同时，图9直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。失拟项P＞0.05，表示该方程可以接受，可以利用该回归方程确定最优的产GABA的培养基成分。

表2 响应面设计的方差分析及回归方程系数显著性检验Table 2 Analysis of variance for the experimental results of RSM design and statistical significance of each regression coefficient in the RSM model

图9 各因素交互影响的响应面法立体分析图Fig.9 Response surface plots showing the interaction effect of factors on the yield of GABA

2.4 植物乳杆菌MJ0301产GABA的优化培养基成分的确定

通过软件Design-Expert7.1求解方程，给出了产GABA的最优培养基组成为：葡萄糖16.20g/L、复合氮源9.78g/L、L-谷氨酸钠29.75g/L，理论预测GABA产量为1.60g/L。考虑到实际操作的局限性，培养基中的各种成分修正为：葡萄糖16.0g/L、复合氮源(胰蛋白胨、酵母膏质量比1:1)10g/L、L-谷氨酸钠30g/L。

为检验结果的可靠性，将植物乳杆菌MJ0301接种到修正后的培养基中于同样条件下培养，测其GABA产量为1.59g/L，与理论预测值基本吻合。

3 结 论

本研究对从黄酒发酵过程中分离得到的一株具有产GABA能力的植物乳杆菌MJ0301进行了发酵培养基的优化，先通过单因素试验(碳氮源种类及其质量浓度、K2HPO4质量浓度、吐温-80添加量、L-谷氨酸钠质量浓度)得到影响植物乳杆菌MJ0301的GABA产量最显著的3个因素。再利用响应面分析法对这3个因素进行分析，以GABA产量为响应值，得到以下结论：1)通过单因素试验，得出对植物乳杆菌MJ0301产GABA量影响最大的3个因素是葡萄糖、复合氮源、L-谷氨酸钠。2)利用响应面分析法设计三因素三水平试验，分析得到优化的培养基条件为葡萄糖16.0g/L、复合氮源(胰蛋白胨、酵母膏质量比1:1)10g/L、L-谷氨酸钠30g/L，此时产量达到1.59g/L，比优化前(143mg/L)提高了10.12倍。

[1]LI Haixing, CAO Yusheng.Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid[J].Amino Acids, 2010, 39(5): 1107-1116.

[2]AKAMA K, KANETOU J, SHIMOSAKI S, et al.Seed-specific expression of truncated OsGAD2 produces GABA-enriched rice grains that influence a decrease in blood pressure in spontaneouslyhypertensive rats[J].Transgenic Res, 2009, 18(6): 865-876.

[3]CHI O Z, HUNTER C, LIU X, et al.Effects of GABA(A) receptor blockade on regional cerebral blood flow and blood-brain barrier disruption in focal cerebral ischemia[J].J Neurol Sci, 2011, 301(1/2): 66-70.

[4]ANOVADIYA A P, SANMUKHANI J J, TRIPATHI C B.Epilepsy:novel therapeutic targets[J].J Pharmacol Pharmacother, 2012, 3(2):112-117.

[5]LU Weiyang.The potential use of GABAergic drugs in the treatment of asthma[J].Future Med Chem, 2011, 3(2): 145-147.

[6]CONNOR M, VAUGHAN C W, VANDENBERG R J.N-acyl amino acids andN-acyl neurotransmitter conjugates: neuromodulators and probes for new drug targets[J].Br J Pharmacol, 2010, 160(8):1857-1871.

[7]YOSIPOVITCH G, BERNHARD J D.Clinical practice.Chronic pruritus[J].N Engl J Med, 2013, 368(17): 1625-1634.

[8]LI Haixing, QIU Ting, HUANG Guidong, et al.Production of gamma-aminobutyric acid byLactobacillus brevisNCL912 using fed-batch fermentation[J].Microb Cell Fact, 2010, 9: 85.doi:10.1186/1475-2859-9-85.

[9]BENARROCH E E.Pedunculopontine nucleus: functional organization and clinical implication[J].Neurology, 2013, 80(12):1148-1155.

[10]El-SAYYAD H I, El-SHERBINY M A, SOBH M A, et al.Protective effects ofMorus albaleaves extract on ocular functions of pups from diabetic and hypercholesterolemic mother rats[J].Int J Biol Sci, 2011,7(6): 715-728.

[11]AITKEN D J, DROUIN L, GORETTA S, et al.Stereoselective preparation ofβ,γ-methano-GABA derivatives[J].Org Biomol Chem,2011, 9(21): 7517-7524.

[12]Di CAGNO R, MAZZACANE F, RIZZELLO C G, et al.Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) byLactobacillus plantarumDSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86(2): 731-741.

[13]Al MARDINI H, Al JUMAILI B, RECORD C O, et al.Effect of protein and lactulose on the production of gamma-aminobutyric acid by faecalEscherichia coli[J].Gut, 1991, 32(9): 1007-1010.

[14]GAWANDE P V, GRIFFITHS M W.Growth history influences starvation-induced expression ofuspA,grpE, andrpoSand subsequent cryotolerance inEscherichia coliO157:H7[J].J Food Prot, 2005,68(6): 1154-1158.

[15]林少琴, 吴若红．壳聚糖固定谷氨酸脱梭酶的研究[J].药物生物技术, 2005, 12(2): 101-105.

[16]MASUDA K, GUO X F, URYU N, et al.Isolation of marine yeasts collected from the Pacific Ocean showing a high production of gamma-aminobutyric acid[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2008,72(12): 3265-3272.

[17]ZAREIAN M, EBRAHIMPOUR A, BAKAR fA, et al.A glutamic acid-producing lactic acid bacteria isolated from malaysian fermented foods[J].Int J Mol Sci, 2012, 13(5): 5482-5497.

[18]BERMUDEZ-BRITO M, PLAZA-D AZ J, MU OZ-QUEZADA S, et al.Probiotic mechanisms of action[J].Ann Nutr Metab, 2012, 61(2):160-174.

[19]钟环宇, 许建军, 江波.利用响应面分析法优化γ-氨基丁酸发酵培养基[J].无锡轻工大学学报, 2004, 23(3): 19-22.

[20]叶水珍, 叶德太.黄酒中氨基酸测定与科学评酒初探[J].中国酿造,1988(2): 25-28.