“班菲”脐橙果皮油斑病相关基因的分析

魏召新，程春振，程昌凤，吴纯清，朱世平，漆巨容，洪 林,*

(1.重庆市农业科学院果树研究所，重庆 402260；2.西南大学柑桔研究所，重庆 400712)

柑橘油斑病(又称油胞病)在世界各地柑橘果皮上普遍发生，田间观察发现，重庆的多个甜橙品种上均有不同程度的表现，其中晚熟脐橙上表现较为突出，7月底在脐橙果实膨大期果皮上有微小病斑出现，成熟期和采后贮藏条件下果皮发病情况加剧。病斑的存在严重影响了果实外观，大大降低了商品价值。目前，国内外业界多数认为，油斑病是由于柑橘成熟期间果皮油胞破裂香精油外渗而引起的生理病害[1]，病症的出现与湿度变化[2]、品种[3]、砧木[4]和营养条件[3]、病虫危害[5]和机械伤害[6-7]等有关，采取相应的 农业技术措施有助于减轻病状的发生程度[5,8]，但至今尚没有确切的油斑病发生的基因调控本质和有效的防控措施，进一步在分子水平上开展相关方面的研究，有助于揭示油斑病发生的分子机理，也有助于从生产上制定更为有效的防治措施，这对于柑橘增效、农民增收具有重要的现实意义。抑制性差减杂交(SSH)技术是一种简便的可用于分离两个mRNA样品间差异表达基因的生物学手段，自其被提出以来，已在小麦[9]、水稻[10]、玉米[11]等植物中得到广泛的应用。SSH技术在柑橘研究中应用也较为广泛，其中高雪[12]、叶庆亮[13]、程春振[14]等以果皮作为实验材料分别构建了脐橙果皮褐变差减文库椪柑果皮与果肉差减cDNA文库和紫外线诱导的梁平柚果皮差减文库。

为从分子水平上了解柑橘油斑病发生的机理，应用抑制性差减杂交技术[15]，分别以脐橙无病斑果皮和有病斑果皮为材料，提取mRNA合成双链cDNA，再分别以二者作为实验方和驱动方，构建了表达基因的正反向文库，获得了一些油斑病诱导的“班菲”脐橙果品差减文库，以期为柑橘油斑病研究提供一定的分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

班菲尔脐橙(Citrus sinesisOsbeck)果实于2010年4月5日采于重庆市奉节县康乐镇铁佛村恒河果业果园，将果实用自来水清洗后用无菌水清洗3遍，拭干后分别削取健康果皮和具油斑病病症果皮，马上置于液氮中，作为RNA 提取材料。

RNA提取试剂盒 美国Invitrogen公司；Oligotex mRNA Mini Kit 德国Qiagen公司；PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit 美国Clontech公司；TaqDNA聚合酶、pMD19-T载体、M-MLV反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM II(Perfect Real Time)、DNA Fragment Purification Kit Ver2.0 Cat TaKaRa生物工程(大连)有限公司。

1.2 仪器与设备

LMS-26E凝胶成像系统 美国UVP公司；AE-6111电泳系统 日本ATTO公司；T-I Thermoblock PCR仪德国Biometra公司；iCycler Thermal Cycler 荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 文库构建

采用Trizol法提取总RNA，使用Oligotex mRNA Mini Kit分离纯化mRNA。按照PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit说明书，分别以感病果实果皮/正常果实果皮双链cDNA作为实验方，以正常果实果皮/感病果实果皮作为驱动方构建cDNA差减文库。第2次PCR产物用产物回收试剂盒回收后，将纯化的PCR产物连接到pMD19-T载体，转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选后挑取白斑以试剂盒中提供的引物进行菌液PCR、AE-6111系统电泳、LMS-26E凝胶成像系统观察，排除假阳性及非单克隆，检测插入片段长度。分3批共从正反向文库中各随机挑选了150个阳性克隆，送华大基因科技股份有限公司进行测序。

1.4 实时定量分析

采用M-MLV反转录试剂盒，以20μL标准反转录体系进行反转录合成cDNA第1链。以反转录产物为模板，进行实时定量RT-PCR验证，以β-actin基因作为内参基因，分别对3个衰老相关基因(基因1、2和3)、DNA结合蛋白基因(基因4)利用实时定量RT-PCR进行了表达验证，引物序列见表1。

表1 实时定量RT-PCR分析所用的引物Table 1 Primers used for real-time RT-PCR

2 结果与分析

2.1 RNA 提取

图1 总RNA凝胶电泳图Fig.1 Electrophoresis of total RNA

由图1可知，实验所得的RNA浓度较高，28S、18S rRNA条带清晰可见，且无杂带和拖尾。用Oligotex mRNA Mini Kit纯化得到的mRNA呈弥散状，弥散带清晰可见，质量较高，可用于文库构建。

2.2 两次PCR检测

对第1次和第2次PCR效果进行检测，并分别以各自未差减的材料为对照，结果如图2所示，差减效果明显，达到文库构建的质量需要。

图2 差减产物的两次PCR结果电泳检测Fig.2 Electrophoresis of subtraction products in two rounds of PCR

2.3 cDNA文库构建情况

电泳结果显示差减之后的PCR产物为弥散状，大小位于200～700bp之间，且多集中于100～500bp。产物分离纯化后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选后挑取单菌落进行培养，并进行菌液PCR验证，电泳检测结果见图3。随机挑的300个阳性克隆，测序成功获得292条ESTs序列。

图3 阳性重组子PCR检测电泳图Fig.3 Electrophoresis of positive clones detected by PCR

2.4 序列分析结果

表2 ESTs在核酸数据库BLASTx搜索结果Table 2 BLASTx results of the ESTs

续表2

由表2可知，所得片段最短为78bp，最长734bp，且大多集中于100～500bp之间，与电泳检测结果相似。利用CAP3对所得序列进行拼接，获得19个重叠群和78条单一序列。把所有ESTs利用BLASTx进行比对分析，在所获得的292条ESTs序列中，有165条ESTs与已知植物物种基因相似度较高，它们分属于55个基因。这些差异表达基因出现频率较高的主要有衰老相关蛋白、DNA结合蛋白、胚胎晚期富集蛋白、MADS蛋白、脱水素、细胞色素P450类TBP蛋白和未知功能的蛋白。其中，出现频率在19次以上的共有3个衰老相关基因，出现频率达70次，占总数的42.4%；其余的基因出现频率不超过9次。在出现频率2～9次之间的基因中，有9个未知功能基因和预测基因出现33次，占总数的20.0%，后续有必要重点对其进一步研究，另有8个已知功能基因出现27次，占总数的16.4%，这8个基因是用于油斑病分析的主要基因。出现一次的基因共35个，占总数的21.2%，其中有19个已知功能基因，尽管这些基因出现的频率低，但也可能是反应体系重要基因，有进一步用于油斑病分析的潜力，如蛋白磷酸酶基因。

2.5 实时定量RT-PCR结果

图4 Real-time RT-PCR结果Fig.4 Results of real-time RT-PCR

采用M-MLV反转录试剂盒，以20μL标准反转录体系进行反转录合成cDNA第1链，以此产物为模板，以在正向文库中获得差异表达的3个衰老相关基因(基因1、2、3)、DNA结合蛋白基因(基因4)序列分别设计引物，以β-actin基因作为内参基因，进行了实时定量PCR验证，各基因的相对表达情况见图4。

2.6 序列结果分析

图5 GO分析的聚类分析结果Fig.5 Gene Ontology annotation as assigned by BLAST2GO

利用BLAST2GO软件对获得基因进行分析，根据分析结果的基因注释统计作图，结果如图5所示。从分子功能分类分析结果可见，参与芳香化酶反应的占11%，参与氧化还原反应的占9%，参与转录因子活性的占8%，参与几丁质酶活性的占7%，参与蛋白结合的占7%，参与转录因子结合的占4%，参与核算结合的占3%，参与金属离子结合的占3%，参与特异多聚A核糖核酸酶活性的占3%。实验所获得的ESTs对应的基因多数参与抗逆防御、生物和非生物胁迫等多种相关的生物学过程，包括参与植物氧化还原反应、胁迫应答、水分应答、细胞壁大分子分解、几丁质代谢、转录调节、细胞增殖、衰老、失水应答、抗逆防御、细胞凋亡、转录与翻译、信号传导、能量代谢、糖类及氨基酸代谢以及次生代谢等多种生理生化过程。这些差异表达基因定位于质膜的占18%，细胞核的占18%，内在膜的占9%，定位于细胞壁、细胞质、胞质膜小泡、内质网、叶绿体、质外体上的各占5%，定位于线粒体、线粒体内模和液泡的各占4%，还有少量的定位于胞外区、质体和细胞骨架。对所获得的ESTs通过提交至Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)，获得了各基因参与的调控途径，主要参与次生代谢产物的生物合成、代谢途径、药物代谢途径和脂肪酸代谢途径等，涉及的酶类主要是单加氧酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、几丁质酶和乙醇脱氢酶等。

3 讨 论

本研究成功构建了晚熟脐橙“班菲”油斑病的正反向差减文库。随机挑取了300个克隆进行测序，获得了292条有效ESTs序列，它们分属19个重叠群和78条单一序列，且均与植物高度同源。实时定量RT-PCR结果表明，4个基因在感病果皮中均上调，与差减结果相一致，说明差减效果可靠。

差减获得ESTs多与抗逆直接相关，从生物学过程分析和调控途径分析的结果来看，差异基因主要是胁迫响应基因。如LEA蛋白是植物体中广泛存在渗透调节有关的家族蛋白，能有效保持细胞膜及生物大分子在逆境条件下的稳定性，该蛋白的编码基因在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫等条件下，其mRNA会大量累积[16]。脱水素是LEA蛋白的1种，在水分胁迫条件下，通过与金属离子结合，减少金属离子对细胞的伤害[17]。几丁质酶是病程相关蛋白，参与植物逆境胁迫响应，在植物受伤后，植物体内几丁质酶含量迅速升高并大量表达，在植物的防御过程中起着重要的作用。此外，液泡加工酶能够调节液泡中相关功能蛋白的活性，当受到伤害、胁迫等逆境时，该蛋白上调表达并诱导衰老相关蛋白，β-葡糖醛酸酶的表达[18]乙醇脱氢酶是乙醛生物合成的关键酶之一，在缺氧[19]、伤害[20]条件下迅速增加，它可能是植物在环境胁迫条件下，植物为适应环境而转换能量代谢的途径，因而也具有一定的抗非生物胁迫的能力。细胞色素P450参与一些脂类物质如类固醇、脂肪酸的合成和代谢[21]和植物防御次生性物质的生物合成过程，还可以催化一些外来物质如药物毒物等的氧化代谢[22]，因而具有解毒作用。

活性氧是植物代谢过程中氧气还原后的副产物[23]，也是一种重要的信号分子，其浓度是影响信号调节的关键因子[24]，过量的活性氧会造成脂质的过氧化、膜透性的增加，破坏细胞组分和结构，甚至导致病斑的出现[25-26]，而调节活性氧浓度的主要是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的过氧化氢酶和过氧化物酶。过氧化氢酶主要存在于细胞的过氧化物酶体中，是生物防御体系的关键酶之一，也是诱导植物体防御基因表达中的一个级联信号[27]，在C3植物降低过氧化氢积累、参与抗逆防御过程中是必需的[28]。过量的过氧化氢能够诱导细胞膜透性和组成的变化，从而对细胞造成伤害，但同时也能促进防御基因的表达[27]。在反向差减文库中获得了过氧化氢酶和过氧化物酶表达基因，可能是这两个基因的表达降低引起活性氧的积累，进而对细胞造成伤害，这种情况相关研究中已有发现[26]。细胞色素P450最常见反应就是单加氧酶反应，可以促进过氧化氢及其反应底物的降解[29]，从而减少对细胞的伤害，在植物的防御反应中起着重要的作用。此外，从差减获得ESTs的定位上来看，超过30%以上的序列定位于各种膜结构上，而且16%的生物学过程中与氧化还原反应直接相关。因此，可以推测氧化胁迫在油斑病的形成过程中起着举足轻重的作用。

从差异表达基因及分子功能可以推测，在柑橘果皮发生油斑病危害过程中，植株通过乙烯、脱落酸、茉莉酸等信号分子，获得了系统性抗性，通过调控基因如脂肪酸合酶、类脂酶、LEA蛋白等基因表达水平，试图抵抗和减少病害危害程度，增强自身耐病能力，而在客观上，油斑病的形成不仅破坏了细胞结构，而且大大增加了果实衰老相关基因的表达水平，进一步加速了果实衰老。

由上述分析可见氧化胁迫与油斑病的形成有密切关系，采取相应能降低活性氧伤害的措施可能有助于减轻油斑病症状、延长果实货架期、从而提高果实的商品价值。但从实验结果来看，仍难以判断引起氧化胁迫的根源是生物伤害或非生物伤害，尽管也有橘油导致氧胁迫的可能，但仍不足以证明光毒性造成的橘油伤害是油斑病发生的根本原因[30]，需要进一步研究以澄清橘油伤害与氧化胁迫之间的关系。橘油或许也是在细胞受到伤害后加剧病症的一种产物，它引起胞外伤害，而氧化胁迫则是自内而外对细胞造成伤害，应是油斑病发生的主要内因，从氧化胁迫入手也将有助于油斑病的研究。

[1]SAWAMURA M, MANABE T, OONISHIK S, et al.Effect of rind oils and their components on the induction of rind spot in citrus species[J].J Hort Sci, 1984, 59(4): 575-579.

[2]ALFEREZ F, BUMS J K.Postharvest peel pitting in citrus is induced by changes in relative humidity[J].Proc Fla State Hort Soc, 2004, 117:355-358.

[3]WILD B L.New method for quantitatively assessing susceptibility of citrus fruit to oleocellosis development and some factors that affect its expression[J].Australian Journal of Experimental Agriculture, 1998,38(3): 279-285.

[4]郑永强, 邓烈, 何绍兰, 等.哈姆林甜橙果实油斑病砧穗特异性调控农艺因子筛选[J].中国农业科学, 2010, 43(23): 4877-4885.

[5]丁舜之.柑桔油斑病的发生原因及预防措施[J].中国南方果树,2002, 31(4): 28.

[6]SCHERRER MONTERO C R, SCHWARZ L L, dos SANTOS L C,et al.Oleocellosis incidence in citrus fruit in response to mechanical injuries[J].Scientia Horticulturae, 2012, 134(2): 227-231.

[7]刘丽丹, 吴日章, 曾凯芳.采后橘油诱导及振动胁迫对贮藏期锦橙果皮油胞病的影响[J].食品科学, 2011, 32(16): 365-369.

[8]郑永强, 邓烈, 何绍兰, 等.树冠喷钙对柑桔果实油斑病及外观品质的影响[J].西南大学学报: 自然科学版, 2009, 31(12): 63-66.

[9]XIAO Kai, BAI Guihua, BRERR fC.Nylon filter array reveal differential expression of expressed sequence tags in wheat roots under aluminum stress[J].Journal of Integrative Plant Biology Formerly Acta Botanica Sinica, 2005, 47(4): 839-848.

[10]GAO Peng, WANG Guoying, ZHAO Huji, et al.Isolation and identification of submergence induced genes in maize (Zea mays)seedlings by suppression subtractive hybridization[J].Acta Botanica Sinica, 2003, 45(4): 479-483.

[11]LI Huiyong, HUANG Suhua, SHI Yunsu, et al.Isolating soil droughtinduced genes from maize seedling leaves through suppression subtractive hybridization[J].Agricultural Sciences in China, 2007,6(6): 647-651.

[12]高雪, 李正国, 樊晶, 等.奉节脐橙果皮褐变差减文库的构建及初步分析[J].植物生理与分子生物学学报, 2007, 33(1): 71-76.

[13]叶庆亮, 江东, 彭爱红.‘岩溪晚芦’椪柑果皮与果肉差减cDNA文库的构建及初步分析[J].园艺学报, 2009, 36(7): 967-974.

[14]程春振, 朱世平, 吴波, 等.紫外线照射对梁平柚果皮基因表达的影响[J].园艺学报, 2011, 38(5): 859-866.

[15]DIATCHENKO L, LAU Y F, CAMPBELL A P.Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Sci Acad USA, 1996, 93(12): 6025-6030.

[16]XU Deping, DUAN Xiaolan, WANG Baiyang, et al.Expression of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice[J].Plant Physiology, 1996, 110(1): 249-257.

[17]HARA M, FUJINAGA M, KUBOI T.Metal binding by citrus dehydrin with histidine-rich domains[J].J Exp Bot, 2005, 56:2695-2703.

[18]TETSU K, KENJI Y, NAGAKO H, et al.Vacuolar processing enzyme is up-regulated in the lytic vacuoles of vegetative tissues during senescence and under various stressed conditions[J].The Plant Journal,1999, 19(1): 43-53.

[19]MATTON D P, CONSTABEL P, BRISSON N.Alcohol dehydrogenase gene expression in potato following elicitor and stress treatment[J].Plant Mol Biol, 1990, 14(5): 775-783.

[20]KATO-NOGUCHI H.Wounding stress induces alcohol dehydrogenase in maize and lettuce seedlings[J].Plant Growth Regulation, 2001,35(3): 285-288.

[21]FREY M, CHOMET P, GLAWISHNIG E, et al.Analysis of a chemical plant defense mechanism in grasses[J].Science, 1997, 277:696-699.

[22]FUNK C, CROTEAU R.Induction and characterization of a cytochrome P450: dependent camphor hydroxylase in tissue cultures of common sage (Salvia off icinalis)[J].Plant Physiol, 1993, 101(4):1231-1237.

[23]MOLLER I M, JENSEN P E, HANSSON A.Oxidative modifications to cellular components in plants[J].Annu Rev Plant Biol, 2007, 58:459-481.

[24]MHAMDI A, QUEVAL G, CHAOUCH S, et al.Catalase function in plants: a focus onArabidopsismutants as stress-mimic models[J].Journal of Experimental Botany, 2010, 61(15): 4197-4220.

[25]GARCIA-PEREZ C, ROY S S, NAGHDI S, et al.Bid-induced mitochondrial membrane permeabilization waves propagated by local reactive oxygen species (ROS) signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012, 109(12): 4497-4502.

[26]CHEN Shiguo, YIN Chunyan, STRASSER R J, et al.Reactive oxygen species from chloroplasts contribute to 3-acetyl-5-isopropyltetramic acid-induced leaf necrosis ofArabidopsis thaliana[J].Plant Physiology and Biochemistry, 2012, 52: 38-51.

[27]PELLINEN R I, KORHONEN M S, TAURIAINEN A A, et al.Hydrogen peroxide activates cell death and defense gene expression in birch[J].Plant Physiol, 2002, 130(2): 549-560.

[28]HILDE W, SANGPEN C, MARK D, et al.Catalase is a sink for H2O2and is indispensable for stress defence in C3 plants[J].The EMBO Journal, 1997, 16(16): 4806-4816.

[29]HRYCAY E G, BANDIERA S M.The monooxygenase, peroxidase,and peroxygenase properties of cytochrome P450[J].Arch Biochem Biophys, 2012, 522(2): 71-89.

[30]KNIGHT T G, KLIEBER A, SEDGLEY M.The relationship between oil gland and fruit development in Washington navel orange (Citurs sinensisL.Osbeck)[J].Annals of Botany, 2001, 88: 1039-1047.