大鼠压疮缺血再灌注模型构建及相关指标观察

黄倩,高玉芳,魏丽丽,陆连芳,张宏岩,马晓燕

(1 青岛大学医学院护理学院,山东青岛 266021; 2 青岛大学医学院附属医院)

大鼠压疮缺血再灌注模型构建及相关指标观察

黄倩1,高玉芳2,魏丽丽2,陆连芳2,张宏岩2,马晓燕1

(1 青岛大学医学院护理学院,山东青岛 266021; 2 青岛大学医学院附属医院)

目的构建大鼠不同分期的压疮缺血再灌注动物模型,并分析其缺血再灌注损伤相关指标的含量变化。方法将64只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、控制对照组、Ⅰ期压疮组、Ⅱ期压疮组、Ⅲ期压疮组、Ⅳ期压疮组、可疑深部组织损伤组、难以分期压疮组,每组8只。采用臀肌下埋置铁片外加磁铁加压的方法构建大鼠压疮缺血再灌注模型,检测并比较各组超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、C反应蛋白(CRP)、局部渗出液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果大鼠各期压疮缺血再灌注动物模型均构建成功。与正常对照组比较,各期压疮组SOD活性明显下降,MDA、CRP含量明显增加,差异有显著性(F＝55.54～156.90,q＝5.026～38.744, P＜0.05);各期压疮组之间比较,差异亦有显著性(q＝4.086～33.642,P＜0.05)。局部渗出液中TNF-α含量Ⅲ期压疮组低于Ⅳ期压疮组,差异有显著性(t＝5.82,P＜0.05)。结论构建6期压疮动物模型并明确各期压疮的生理变化,可为压疮相关实验研究和临床治疗提供理论依据。

压力性溃疡;缺血;再灌注损伤;大鼠,Sprague-Dawley

压疮一直是长期卧床病人难以解决的一大皮肤难题。在压疮治疗方面,临床观察研究居多,基础研究相对较少。国内外关于早期压疮动物模型制备和形成机制的研究较多,但大多是根据1989年4期压疮分期标准或更早的压疮分期标准而构建出的Ⅰ期、Ⅱ期早期压疮动物模型。本实验根据2007年美国国家压疮指导专家组(NPUAP)新公布的6期压疮分期标准[1],在WASSERMANN等[2]造模方法的基础上,制备6期压疮动物模型,并检测各期压疮再灌注损伤相关指标的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠64只,月龄12～14周,体质量(220±20)g,由我院附属医院动物实验中心提供。单笼饲养,自由进食、饮水,室内温度维持在22～30℃,相对湿度50%～70%,明暗周期12 h。

1.1.2 试剂与材料 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、C-反应蛋白(CRP)及肿瘤坏死因子α (TNF-α)ELASA检测试剂盒,均由南京建成生物工程研究所提供。圆形铁片(直径为12 mm,厚度1 mm,质量1 g)和圆形磁铁(直径为12 mm,厚度2.5 mm,质量2 g),均购自青岛青磁材料有限责任公司。磁铁的磁通量密度为为0.16 T[3]。铁片在植入皮肤前均经高压蒸汽灭菌处理。

1.1.3 主要仪器 可见光分光光度计,37℃恒温气浴箱,台式离心机,可调到95℃左右的恒温水浴箱,标准规格酶标仪,精密移液器,一次性吸头,试管等。

1.2 动物分组和模型建立

将64只大鼠随机分为正常对照组、控制对照组、Ⅰ期压疮组、Ⅱ期压疮组、Ⅲ期压疮组、Ⅳ期压疮组、可疑深部组织损伤组、难以分期压疮组,每组8只。大鼠适应性生活2周后,正常对照组不做任何处理,继续给予饲料正常喂养。余下的7组大鼠禁食12 h,自由饮水,用100 g/L水合氯醛(350 mg/ kg)腹腔注射麻醉后,臀部剪毛、备皮4 cm×5 cm大小,再用聚维酮碘消毒液对备皮区进行消毒;在大鼠臀部做一深至肌肉层的切口,长约2 cm,钝性分离肌肉组织;将铁片植入大鼠臀部肌肉下,缝合肌肉组织和筋膜,然后连续缝合皮肤层,再用碘附消毒以防止感染。控制对照组大鼠只给予铁片植入;剩余的6组大鼠术后24 h在植入铁片的皮肤外放置磁铁,从而对皮肤及肌肉组织产生压力,造成局部组织缺血,每次缺血2 h后将外源磁铁取下30 min,让局部血流恢复,此操作为1个循环。

1.3 观察指标和方法

1.3.1 血清CRP和TNF-α检测 采用断尾取血法采集大鼠尾静脉血1 m L(取血前禁食12 h),收集创面局部渗出液,室温放置1 h后将标本置－20℃冰箱冻存待测。待全部标本收集完毕后,3 000 r/ min离心15 min分离血清,分别应用大鼠CRP和TNF-α的ELASA试剂盒检测CRP含量和TNF-α含量,严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.2 血清SOD活性和MDA含量测定 将各组大鼠麻醉后采集腹主动脉血5 m L,放入不含抗凝剂的试管中,以3 600 r/min,4℃离心10 min,取血清。用分光光度计根据SOD和MDA试剂盒操作步骤检测血清中SOD活性和MDA含量。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 肉眼观察

本文64只大鼠全部进入结果分析,数据无缺失。根据2007年NPUAP公布的6期压疮分期标准[1],1个循环后大鼠皮肤虽完整但出现了压之不褪色的红斑,Ⅰ期压疮组造模成功;5个循环后大鼠受压处皮肤出现粉红色的破损,Ⅱ期压疮组造模成功;25个循环后大鼠受压处全层伤口,失去全层皮肤组织,除了骨、肌腱或肌肉尚未暴露外,可见皮下组织,Ⅲ期压疮组造模成功;35个循环后大鼠受压处全层伤口,失去全层皮肤组织,损伤深达肌肉组织,露出铁片,Ⅳ期压疮组造模成功;15或20个循环后大鼠受压处皮肤呈紫色,出现瘀伤但局部皮肤完整,在肤色较深部位的组织损伤可能难以发现,可疑深部组织损伤组造模成功;30个循环后大鼠受压处全层伤口,失去全层皮肤组织,溃疡被腐痂或痂皮覆盖,只有腐痂或痂皮充分去除,才能确定真正的分期,难以分期压疮组造模成功。

2.2 各组大鼠CRP和TNF-α含量比较

各期压疮组与正常对照组比较、各期压疮组之间比较,血清CRP含量差异均有统计学意义(F＝132.61,q＝5.688～38.992,P＜0.01);控制对照组与正常对照组比较,CRP含量差异无显著性(P＞0.05)。Ⅳ期压疮组局部渗出液中TNF-α含量明显高于Ⅲ期压疮组,差异有统计学意义(t＝5.82,P＜0.05)。见表1。

2.3 各组大鼠血清SOD活性和MDA含量比较

各期压疮组SOD活性、MDA含量比较,差异有显著性(F＝55.54、156.90,q＝3.330～38.744, P＜0.05);控制对照组与正常对照组SOD活性和MDA含量比较,差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

2.4 各期压疮组各指标相关性

将6期压疮组(共48只)CRP、SOD、MDA值进行相关性分析,SOD与CRP、MDA呈显著负相关(r＝－0.940、－0.938,P＜0.01),CRP与MDA呈显著正相关(r＝0.970,P＜0.01)。Ⅲ期、Ⅳ期压疮局部渗出液中TNF-α与血清CRP、MDA呈正相关(r＝0.680、0.671,P＜0.05),与SOD呈负相关(r＝－0.678,P＜0.05)。

3 讨 论

3.1 压疮缺血再灌注损伤模型构建

压疮是由多因素共同作用形成的,其发生机制也存在着多种不同的假说,其中缺血再灌注损伤学说是当今国内外研究的热点之一[4]。本实验借鉴了WASSERMANN等[2]的裸鼠4期压疮模型的实验方法,通过改变缺血再灌注的循环数成功构建了大鼠6期压疮缺血再灌注模型,随着缺血再灌注循环数的增加,即缺血再灌注损伤时间的增加,其皮肤损伤程度逐渐加重。该方法最突出的优势是整个受压和解压过程中实验大鼠均处于非麻醉状态,可以排除麻醉因素对一些生化指标的影响;但另一方面,该模型需提前植入铁片,额外增加了皮肤和肌肉组织的损伤,有可能影响后期实验观察。本实验中所有用到的铁片在移植前均经高压灭菌,严格执行无菌操作原则,将其对结果的影响降到最小。为确保数据的准确性,本研究设了控制对照组(只植入铁片,未给予缺血再灌注循环操作),结果显示控制对照组与正常对照组之间各指标结果差异无显著性,说明采用该方法造模不会影响结果。

表1 各组各指标检测结果比较(n＝8,±s)

_____组__别__________________CRP(ρ/μg·L－1)_______TNF-α(ρ/ng·L－1)SOD(z/k U·L－1)MDA(c/μmol·L－1)正常对照组228.99±4.63－187.19±4.97 7.61±0.55控制对照组230.88±4.48－184.11±6.83 8.01±0.46Ⅰ期压疮组260.80±13.22－173.77±7.78 8.80±0.57Ⅱ期压疮组284.84±12.69－155.75±7.07 13.68±0.72Ⅲ期压疮组363.74±16.46 21.42±1.02 134.57±7.34 27.97±0.87Ⅳ期压疮组448.94±22.50 24.83±1.31 115.56±6.69 36.31±1.11可疑深部组织损伤组327.34±20.65－144.84±11.35 21.83±2.00 ___难以分期压疮组_____________403.12±20.51______________________________________________________________________________________ ____________－125.68±6.85 31.66±5.27

3.2 压疮缺血再灌注损伤模型各指标变化及意义

3.2.1 CRP、TNF-α含量变化及意义 近年来,再灌注损伤与炎症之间的关系备受关注,但关于炎症与皮肤缺血再灌注损伤关系的研究较少。CRP和TNF-α都是反映体内炎症水平的重要指标,但尚未有研究证实CRP和TNF-α与各期压疮发生发展的关系。本实验结果显示,随着缺血再灌注循环数的增加,压疮严重程度越来越重,各期压疮组CRP含量也逐渐增加,差异有显著性;在造模过程中只有Ⅲ期和Ⅳ期压疮组出现了渗液,Ⅳ期压疮组TNF-α高于Ⅲ期压疮组,差异有显著性。说明炎症反应并非仅仅发生在压疮早期,它是贯穿在整个压疮发生、发展过程中的。伴随着缺血再灌注循环数的增加,体内炎性反应逐渐加重,皮肤损伤程度也逐渐增加。本文相关分析结果显示,Ⅲ期、Ⅳ期压疮局部渗出液中TNF-α与血清CRP之间存在着正相关,说明在炎症反应启动后,两种炎性因子可能会互相激活,从而增强炎性损伤。因此,炎性因子的作用是缺血再灌注损伤发生的重要机制之一。这与张纯瑜等[5]的结论相一致。提示在今后的各期压疮治疗过程中,抗炎治疗均应作为不可忽视的措施之一。

3.2.2 SOD活性和MDA含量变化及意义 有作者对不同压迫缓解时间下SOD活性和MDA含量的变化及意义进行了研究,结果显示,若在短时间内局部重复受压,则可能加大压疮发生的危险性[6-7]。本文结果显示,随着缺血再灌注循环数的增加,各期压疮组SOD活性逐渐降低,MDA含量逐渐增加,差异均有统计学意义,且SOD和MDA之间存在着负相关。说明当皮肤发生缺血再灌注损伤时,体内的自由基生成增多可引发组织氧化应激反应,导致MDA含量增加;自由基还可使SOD失去活性,失活的SOD不能有效地清除自由基,MDA含量也因而进一步升高,这样就形成了一个恶性循环。这与郭树忠等[8]的结论相一致。在压疮形成过程中,氧自由基起着重要的作用,SOD、MDA联合检测可有效判断压疮的严重程度。

本研究在相同的实验操作人员、实验条件下,采用相同的实验方法,根据同一压疮分期标准构建出的6期压疮动物模型更具客观性,可为各期压疮研究提供基础。

[1]BLACK J,BAHARESTANI M,CUDDIGAN J,et al.National pressure ulcer advisory panel’s updated pressure ulcer staging system[J].Dermatology Nursing,2007,19(4):343-349.

[2]WASSERMANN E,MV G,GSTALTNER K,et al.A chronic pressure ulcer model in the nude mouse[J].Wound Repair and Regeneration,2009,17(4):480-484.

[3]PEIRCE S M,SKALAK T C,RODEHEAVER G T.Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation:a skin model in the rat[J].Wound Repair and Regeneration:Official Publication of the Wound Healing Society and the European Tissue Repair Society,2000,8(1):68-76.

[4]BLEBEA J,KERR J C,PADBERG F T J R,et al.Triphenyl tetrazolium chloride as a histochemical marker of skeletal muscle ischemia and reperfusion injury[J].Current Surgery, 1987,44(2):134-136.

[5]张纯瑜,崔飞飞,张龙,等.IL-1在Ⅰ期压疮中的作用及表达[J].护理学杂志,2011,26(24):1-4.

[6]姜丽萍,蔡福满,杨晔琴,等.不完全皮肤受压对大鼠组织损伤影响的实验研究[J].中华护理杂志,2007,42(9):776-778.

[7]蔡福满,姜丽萍,杨晔琴,等.氧自由基损伤在压疮形成中的作用机制实验研究[J].护理学杂志,2008,23(14):12-14.

[8]郭树忠,汪良能,鲁开化,等.自由基对缺血游离皮瓣的损伤和超氧化物歧化酶抗损伤作用的实验研究[J].中国修复重建外科杂志,1995,9(2):104-107.

(本文编辑 黄建乡)

CREATION OF PRESSURE ULCER ISCHEMIC-REPERFUSSION MODEL IN RATS AND OBSERVATION OF RELATED INDICA-TORS

HUANG Qian,GAO Yufang,WEI Lili,LU Lianfang,ZHANG Hongyan,MA Xiaoyan (Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

ObjectiveTo create models of different-stage pressure ulcer ischemic-reperfusion(PUIR)in rats and analyze its related indicators.MethodsSixty-four Sprague Dawley rats were equally randomized to eight groups as follows:normal group,control group,stage-Ⅰ-,stage-Ⅱ-,stage-Ⅲ-,stage-Ⅳ-PU group,suspected-deep-tissue-injury group and hard-to-staging-PU group.A rat model of PUIR was created by implanting an iron plate in gluteus and pressed with magnetic iron from outside.The content of superoxide dicmutase(SOD),malondialdehyde(MDA),C-reactive protein(CRP)and tumor necrosis factor-α (TNF-α)in the local exudate in each group were detected.ResultsEach-stage rat PUIR models were successfully created.Compared with the normal group,the activity of SOD in each group of different-stage PUIR was declined,while the content of MDA and CRP elevated,the differences being significant(F＝55.54－156.90,q＝5.026－38.744,P＜0.05);as compared between each PUIR group,the differences of that showed significance as well(q＝4.086－33.642,P＜0.05).The content of TNF-αin local exudate in stage-Ⅲ-PU group was lower than that in the stage-Ⅳ-PU group(t＝5.82,P＜0.05).ConclusionConstructing sixstage PU animal models and identifying physiological changes in different stages of PU can provide theoretical basis for PU-related experimental research and clinical therapy.

pressure ulcer;ischemia;reperfusion injury;rats,Sprague-Dawley

R471

A

1008-0341(2013)04-0365-04

10.11712/qlyx201304028

2013-03-01;

2013-06-14

青岛市科技局计划课题(2010KZJ-37)

黄倩(1987-),女,在读硕士研究生。

高玉芳(1959-),女,主任护师,博士生导师。