中国益生菌类产品的质量控制现状

■林 俊 段智勇 罗 正

(建明工业（珠海）有限公司，广东珠海 519040)

在国外，早在60、70年代就开始着手于枯草芽孢杆菌的研究与应用，目前已广泛地应用于各种动物养殖和工厂化的饲料生产中。我国虽起步较晚，但目前在枯草芽孢杆菌的作用机理和推广与实际应用方面取得了较快的进展。国内益生菌生产厂家已达上百家，菌种多样，产品质量也千差万别，在这种历史背景下，枯草芽孢杆菌类益生菌产品也存在质量控制、检测方法不统一，产品标识不规范等问题，这些都有待改善和提高。

1 益生菌常用的检测方法及存在问题

1.1 常用的几种检测方法

目前市场上的枯草芽孢杆菌类产品众多，产品规格标识不统一。有些产品标的是活菌数，有些标的孢子数，甚至还有些厂家的产品标识值模棱两可，标识不明确导致饲料生产企业和养殖企业购买后使用困难或者效果不稳定。例如，某些厂家销售的枯草芽孢杆菌规格标明“100亿/g”的，但是100亿个枯草芽孢杆菌并不等同于能产生100亿个芽孢，有些不产芽孢的活菌高温下会死亡；市面上有的产品标识芽孢数为“100亿/kg”，在实验室通过平板计数法等相关检验方法也的确能够检测到这么多的芽孢数，但是因为形态一样，最终没有办法分辨出内部包含有多少非芽孢的营养体和不完整的芽孢，更不能检测出释放的芽孢数是多少，这样就会使生产出来的产品达不到配方设计时的芽孢数，所以效果会很不稳定。一般出现这种问题，无法快速准确找出原因所在，最终在客户层面的结果是产品品质差，公司层面认为产品开发失败。在我国，由于仪器设备和检测方法的限制，一般多采用常规检测方法进行检测，如：平板稀释计数法、显微镜测数法、浊度测定法等。①平板稀释计数法是将待测样品按设定比例稀释，让其中的单个细胞充分分散均匀，先后经过接种，培养，形成肉眼可见的菌落（培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌）。计数其单一菌落个数从而换算出细菌总数，通过特定的染色手段还可以定量区分出活菌数。缺点是由于菌落容易生长在一起，导致结果容易偏低。②显微镜测数法是将细菌（或其他微生物）用染剂（例如结晶紫）染色后，直接以显微镜观察方式计数，再推算回细菌数，所得即为总菌数，缺点是死菌、活菌共同计算，产品活菌的含量低于实际含量。③浊度测定是利用光电比色计在特定波长的条件下，通过含细菌（或其他微生物）的均匀悬浊液，测其吸收率或折射率。建立数据库，利用回归曲线迅速测出总菌数，缺点也是死菌、活菌一起计算，还会受到载体的干扰。

通过上面对三种测量方法的分析，不难看出，比较具有操作可行性的首推“平板稀释计数法”，实际上“平板稀释计数法”也是目前国内最常用、最稳定可靠的活菌计数。建明实验室在此基础上进行优化改进，有效地分离即将粘连生长的多个细胞（结果见图1、图2），使检测结果更加准确，从而保证饲料添加量一致，饲料品质稳定。

1.2 检测中存在的常见问题

1.2.1 不同产品标识数与实测数的不一致

由于计数方法的不统一，客户基本不进行计数，计数时间长需要专人操作等原因，造成使用后产品质量不稳定，不仅如此，很多益生菌生产企业也不对产品进行活菌计数。表1是建明公司用优化的平板计数法对不同产品进行细菌计数的结果，从表1可以看出，不同的产品之间存在着很大的差异，产品A实际活菌数比检测结果相差了300倍，而建明的产品孢子数比标识的高0.5倍。所以在选择益生菌时不能光看标识，还要看检测结果。

图1 普通平板计数结果

图2 优化方法计数结果

表1 不同益生菌产品标识数与实测数的对比

1.2.2 难以区分芽孢和营养体

芽孢杆菌采用有效芽孢数的计算方法，目的是为去除非芽孢的营养体和不完整的芽孢，保证芽孢数的准确性。既然是枯草芽孢杆菌的检验，一定会涉及到芽孢的概念，众所周知，芽孢是在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体所产生的孢子，耐酸碱、高温和挤压，在配合饲料制粒过程可以很好的加入到环模造粒机，单双螺杆膨化机中进行全价配合饲料的生产。

以往大家可能会认为活菌数是衡量枯草芽孢杆菌产品的唯一指标，但是在现代饲料制作过程中，以活菌存在的枯草芽孢杆菌制剂会受到来自饲料原料颗粒，如：豆粕、玉米、面粉、鱼粉甚至多维多矿等众多粉体原料的摩擦和挤压，从而使菌体破裂导致死亡，尤其是在水产类饲料的生产过程中，经过饱和蒸汽一次调质，甚至二次调质，再通过单螺杆膨化机，甚至双螺杆膨化机挤压膨化后，在膨化腔中会出现暂时的高温，温度有时会超过120℃，甚至更高，这样的话损失就会更大。所以，对于要保证活菌数的市售枯草芽孢杆菌类产品来讲，光有菌体是不行的，芽孢才是关键。

1.2.3 研发和生产过程中缺乏适当的品控也会导致计数的失误

关于芽孢杆菌最初筛选的来源，各大生产商也是大相径庭：有的是从健康动物肠道中经过长期地反复筛选优化得到的最初菌株；有些中间步骤就没有那么细致，得到的纯度大打折扣；还有一些通过合成的方法也能得到相关的菌株，也有几个方面兼而有之的，总之在菌株的筛选上，各有各的途径，或缜密严谨，或马虎了事。

有了好的菌种来源，还要有好的工艺和方法才能持续地把好的优势保持下来，减少菌种退化。其中，生产工艺条件对微生态制剂发挥功效具有很大影响，目前常用的发酵技术，主要包括液体深层发酵和固体发酵。比较而言，液体深层发酵技术在菌体生长速度、菌种污染率、生产周期和无季节影响方面占据优势，是很多企业发展的方向。

2 科学的质量控制

针对上述益生菌质量控制的主要问题，需要从以下几个方面进行控制。

2.1 从菌种的选择上保证其有效性

克洛生(ClOSTAT)产品在活性成分的筛选上是严格的：产品所含有的活性成分是从健康动物肠道中分离出来的，获得美国专利的枯草芽胞杆菌PB6菌株的孢子；能分泌细菌素有效抑制病原菌，如产气荚膜梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌。不仅如此克洛生™PB6活性菌株也已经通过了EFSA（欧洲食品安全局）的审核及食品链与动物健康常务委员会的审核，现已大量使用在欧洲畜禽养殖中。

CLOSTATTM系列产品与其他产品在相同条件下抑菌面积对比数据见表2。

表2 CLOSTATTM与其他产品在相同条件下抑菌效果对比

2.2 在生产工艺上严格把关

在发酵工艺选择上，为确保每一批的枯草芽孢杆菌PB6都是在严格的控制下进行生产，选择性地利用先进的液体发酵技术，并通过严格的质量控制手段，在生产过程中核实每一批产品的枯草芽孢杆菌孢子数。在每批克洛生(CLOSTAT)产品生产之后，又非常严格地控制成品的枯草芽孢杆菌孢子数，通过以上的层层把关，保证克洛生(CLOSTAT)产品能够持续的提供并符合理想健康肠道的要求。

2.3 质量控制中严格区分芽孢和营养体

在关键的步骤中，将待测产品放入水浴加热10 min，杀灭成熟菌体的同时保证芽孢不会失活，同时通过优化方法有效地分离即将粘连生长的多个细胞，严格区分芽孢和营养体，使检测结果更加准确。保证用户添加到饲料中的孢子含量稳定一致。

2.4 用ERP系统保证可追溯性

在产品制造方面，拥有完善的质量保证体系，能够沿着“供应商原料采购，工厂生产控制，最终成品运输”这一整条线路进行监控和双向追溯。具体地说是这样的：公司使用在生产中所有原材料，都要按照检验标准进行理化指标、微生物指标和感官分析等多重检测，合格后才可以用于生产；每批产品生产时，均被ERP系统自动分配特定的质量控制批号，这样我们可以通过此批号追溯原料使用、产品制造的数据，为以后的指定追踪提供证据；在产品生产的各个阶段，我们的质检人员也会按照检验标准对产品进行监控取样，确保产品品质；产品在最后进入包装工序后，质检人员会再次按照抽样要求抽取成品样品，确保成品符合严格的质量标准和要求。

3 良好质量控制下的益生菌在肠道中的表现

经过科学质量体系控制下的益生菌，能够充分发挥其在肠道中的功能，取得较好的生产效益。

枯草芽孢杆菌作为益生菌成员之一，由于其特殊的生化特性被广泛地应用在饲料生产、水处理和各类养殖业中；由于其好氧、可产芽孢、耐酸碱、耐高温和挤压，被广大饲料工作者作为营养调节剂，普遍地使用在各类饲料生产中。

作为营养调节剂加入的枯草芽孢杆菌以芽孢的形式存在，在动物的胃肠道中比较稳定，特别是在酸性环境中具有高度的稳定性。当他们进入肠道后迅速生长繁殖消耗环境中的游离氧，造成低氧的环境，促进肠道有益厌氧菌生长，产生乳酸等有机酸降低肠道pH值，从而间接抑制其它致病菌生长。还有一类枯草芽孢杆菌能分泌细菌素直接杀灭病原菌，达到减少抗生素使用的目的，保证肠道健康的效果，即功能性益生菌。比如克洛生TM可以分泌表面素A和表面素B，对梭菌的抑制效果与恩拉霉素相当，同时可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌的致病菌。但是想要达到保护肠道健康，控制有害病菌的效果，光有好的菌株还不行，益生菌产品的品质是关键，且受到多个因素的影响。

4 小结

由于生产工艺、质量控制、以及菌株特性的不同，使枯草芽孢杆菌类产品质量差异很大。对于使用者来说在选择枯草芽孢杆菌类产品时，务必进行多方面对比，了解产品标签中的有效信息，并结合工厂的实际情况进行选择。必要的时候进行实验室的检测，挑选检测结果与标识或说明书一致的产品，尤其是在抑菌能力方面。只有好的能抑制病原微生物的微生态制剂才能保证饲料产品品质出众，保证肠道健康，提高畜禽生产性能。