超声辅助酶解葛根粉及其响应面优化工艺的研究

钟红兰，窦晓凤，熊 华，张 忠，彭海龙，史 卿，阮 霞，白春清

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047)

葛根，是豆科植物葛的可食性块根［1］。新鲜葛根的淀粉含量在20%～25%［2］，葛根粉是从葛根中提取的淀粉，含有异黄酮类物质如黄豆甙、葛根素、葛根醇等［3］。葛根异黄酮具有抗氧化、抑菌、抗癌、降血糖、降血脂等作用［4-6］。葛根淀粉在冷水中不溶，热水中溶胀，熟淀粉糊黏度大，冲调性差，其应用受到一定的限制［7］。α-淀粉酶，主要作用于淀粉分子中的α-1，4-葡萄糖苷键，将淀粉切分成糊精及少量低分子糖，能降低淀粉糊的黏度［8］。酶法处理手段温和，能较高程度地保留葛根粉功能性成分，用α-淀粉酶对葛根粉酶解处理可以获得很好的冲调效果，便于后续加工和食用。α-淀粉酶按作用温度分为低温、中温和高温α-淀粉酶。本实验室前期研究表明，选用中温α-淀粉酶进行酶解，采用超声波辅助酶解，可以达到能耗少、酶用量低的目的。本研究继而在单因素实验的基础上，通过响应面分析法优化酶解工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛根粉 市售;中温α-淀粉酶 4000U/g，山东隆大生物工程有限公司;3，5-二硝基水杨酸、氯化钙等化学试剂 均为分析纯。

BS 224S型电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;SK2210HP型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;PHS-3C型精密pH计 上海雷磁新泾仪器有限公司;UV-2450型紫外分光光度计日本岛津公司;BM-FG103型手持糖量折光仪 上海康路仪器设备有限公司;FD-1型冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司;Quanta200F型环境扫描电子显微镜 荷兰FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根粉超声辅助酶解工艺 称取葛根粉→调浆→加氯化钙→调节pH→水浴控温→酶解→超声→继续酶解→灭酶→冷却→得酶解液

1.2.2 超声辅助处理条件的确定 在60℃下，控制pH在6.0～6.5，固形物浓度(即葛根粉质量浓度) 20%，中温 α-淀粉酶添加量为 0.5%，酶解时间15m in，采用单因素实验法研究超声功率及超声时间对葛根粉酶解液DE值的影响。

1.2.3 单因素实验 根据1.2.2的实验结果选择合适的超声功率和时间，以DE值为指标，利用单因素法依次探究固形物浓度、酶解时间、酶添加量以及温度对DE值的影响。

1.2.4 响应面实验设计 根据单因素实验确定酶解工艺的参数范围，设计以固形物浓度、酶解时间及酶添加量为因子的3因素3水平响应面优化实验，实验因素水平设计见表1，建立模型以预测结果，并做验证实验。

表1 实验因素水平Table1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 考察指标的测定 DE(Dextrose Equivalent，葡萄糖当量)值:还原糖(以葡萄糖计)占总固形物的百分比［9］，反映淀粉的水解程度。还原糖含量的测定采用DNS比色法［10］。

1.2.6 葛根粉微观形态观察 采用扫描电镜(SEM)法。

2 结果与讨论

2.1 超声辅助处理条件的确定

2.1.1 超声功率对DE值的影响 固定超声时间为10m in，超声结束后继续酶解5m in(总的酶解时间为15m in)，加1mol/L的HCl调节pH至4.77，并将酶解液于沸水浴中保温5m in以达到灭酶的效果［11］。考察超声功率50～100W对葛根粉酶解液DE值的影响。结果如图1所示。

图1 超声功率对DE值的影响Fig.1 Influence of ultrasonic power on DE value

由图1可见，在本实验研究范围内，超声功率的增大有助于葛根粉的水解，且超声功率为100W时，葛根粉酶解液DE值最大，从仪器的保养上考虑，后续实验选择在90W的超声功率条件下进行。

2.1.2 超声时间对DE值的影响 在90W功率条件下超声，酶解15min，考察超声时间对葛根粉酶解液DE值的影响。结果如图2所示。

图2 超声时间对DE值的影响Fig.2 Influence of ultrasonic time on DE value

由图2可知，采用了超声处理的葛根粉水解程度明显高于未经超声处理组(超声时间为0)，超声时间低于10m in时，葛根粉水解程度与超声时间呈正相关，10m in时，DE值达最大，超过10m in后，DE值略微减小，原因可能是酶活性受到了抑制，这与超声波作用于酶的复杂机制有关。因此，后续实验的超声时间选择10min。

2.2 单因素实验

2.2.1 固形物浓度对DE值的影响 在60℃下，pH在6.0～6.5，中温 α-淀粉酶添加量为0.5%，酶解15m in(90W超声功率下超声10m in)，考察固形物浓度对DE值的影响。

图3 固形物浓度对DE值的影响Fig.3 Influence of solids concentration on DE value

从图3可以看出，固形物浓度在15%～30%范围内，随固形物浓度的增大，葛根粉酶解液DE值逐渐增大，当固形物浓度超过30%以后，DE值有小幅度下降，可能是底物浓度过大，阻碍了酶与底物的充分接触，导致DE值的减小。

2.2.2 酶解时间对DE值的影响 在60℃下，pH在6.0～6.5，固形物浓度为20%，中温α-淀粉酶添加量为0.5%，超声辅助时间都为10m in，分别测定不同总酶解时间(包括超声时间)下的酶解液DE值，考察酶解总时间对DE值的影响。

由图4可知，反应初始阶段，随着反应的进行，DE值迅速增大。反应进行30m in后，随着时间的延长，DE值变化不显著，表明反应已趋于平衡状态。

2.2.3 中温α-淀粉酶添加量对DE值的影响 在60℃下，pH在6.0～6.5，固形物浓度为20%，酶解15m in(90W超声功率下超声10m in)，考察中温α-淀粉酶添加量对DE值的影响。

图4 酶解总时间对DE值的影响Fig.4 Influence of hydrolysis time on DE value

图5 中温α-淀粉酶添加量对DE值的影响Fig.5 Influence of the amount of enzyme on DE value

由图5可知，酶添加量在0.2%～0.8%范围内，葛根粉酶解液的DE值随中温α-淀粉酶的增加而明显增大，但酶添加量大于0.8%时，DE值变化不大。将酶添加量控制在一定水平内，有利于节约成本。

2.2.4 酶解温度对DE值的影响 pH在6.0～6.5，固形物浓度为20%，中温α-淀粉酶添加量为0.5%，酶解15min(90W超声功率下超声10min)，考察酶解温度对DE值的影响。

从图6中可以看出，在45～60℃范围内，DE值随反应温度的升高而增大，60℃时达最大(11.63%)，温度高于60℃后，DE值呈缓慢下降的趋势。说明本实验所用中温α-淀粉酶的最适作用温度为60℃，低于或高于此温度，将会影响酶反应效果。

图6 酶解温度对DE值的影响Fig.6 Influence of hydrolysis temperature on DE value

2.3 响应面实验

根据Box-Benhnken中心组合设计原理，综合单因素结果，选择60℃为反应温度，以DE值为响应值，固形物浓度、酶解时间及酶添加量为影响因子，设计3因素3水平的响应面分析实验。实验设计及其结果见表2。

表2 实验设计及结果Table2 Results of response surface experiments

2.3.1 响应面分析与模型的建立 利用软件(SAS9.1.3)对表2的数据进行回归拟合分析，得到因子X1(固形物浓度)、X2(酶解时间)、X3(酶添加量)与响应值Y(DE值)间的关系方程:

对上述模型进行方差分析及显著性评价，结果见表3。

由表3可知，所建回归模型的水平为差异极显著(p＜0.01)，且失拟项不显著(p=0.487827);模型的决定系数R2为98.62%，表明该回归模型与实验数据的拟合性较好，能够解释DE值的变化，可用于预测实际情况。在实验范围内，各影响因子对Y值的响应程度为:X3＞X2＞X1，即:酶添加量＞酶解时间＞固形物浓度。

根据回归方程，将一个影响因子固定在其中心水平(Xn=0)，得到其它两个因子交互作用的响应曲面，见图7～图9。

响应曲面图表明，实验中各因子间的交互作用不明显，尤其是酶解时间与固形物浓度间的交互作用最弱;酶添加量对DE值的影响最大，其次是酶解时间，固形物浓度对DE值的影响最小，与方差分析的结果一致。

2.3.2 最佳酶解条件的确定及验证 利用软件求得回归方程的最优解，对应的各编码值为:X1=-0.07950、X2=0.39512、X3=1.30065，此时 Y= 19.19%，即最佳酶解条件为固形物浓度29.6%、酶解时间32min、酶添加量1.19%，此时模型预测 DE值为19.19%。

为进一步验证回归模型的有效性，以优化结果进行3次重复实验，测得平均DE值为19.13%，接近于预测值，表明模型可靠，预测结果准确。

表3 回归模型方差分析及显著性检验Table3 Variance analysis results of regressionmodel

图7 酶添加量与酶解时间对DE值影响的响应曲面图Fig.7 Response surface of the amount of enzyme and hydrolysis time on DE value

图8 酶添加量与固形物浓度对DE值影响的响应曲面图Fig.8 Response surface of the amount of enzyme and solids concentration on DE value

2.4 葛根粉酶解前后的微观形态观察

图10、图11分别为原料葛根粉、冷冻干燥后的葛根粉酶解物的扫描电镜(SEM)图。

由图10和图11可见，原葛根粉颗粒呈外表面光滑、致密的多角形结构，而经冻干的酶解物颗粒外表面不光滑，呈疏松的不规则片状结构。结果表明由于α-淀粉酶的作用，葛根淀粉颗粒崩解，表面积增大，变得疏松、易于溶解。

图9 酶解时间与固形物浓度对DE值影响的响应曲面图Fig.9 Response surface of hydrolysis time and solids concentration on DE value

图10 葛根粉SEM图(×3000)Fig.1 0 SEM image of Kudzu root starch(×3000)

3 结论

利用超声进行辅助酶解葛根粉，明显的提高了酶解效率。根据单因素实验结果及实际操作情况，确定了超声条件，即超声功率为90W、超声时间为10m in。以单因素实验为基础，采用响应面法优化葛根粉酶解工艺，对其结果进行分析，得到了可靠的数学模型。方差分析表明，选取的3个影响因子中酶解时间和中温α-淀粉酶添加量对DE值影响极为显著，固形物浓度的影响不显著。最终确定的最优酶解条件为:固形物浓度29.6%，酶解时间32m in，酶添加量1.19%。模型预测该条件下的酶解液DE值为19.19%，实测DE值为19.13%，模型可靠性得到验证。对葛根粉酶解前后的微观结构进行了观察，结果表明，未经酶解的葛根粉颗粒为表面光滑、致密的多角形结构，而其酶解物呈疏松的不规则片状结构，葛根粉颗粒酶解后变得疏松、易于溶解。

图11 葛根粉酶解物SEM图(×200)Fig.1 1 SEM image of Kudzu root starch after hydrolysis(×200)

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