钙结合蛋白在C57BL/6小鼠内耳细胞发育过程中的表达特点△

田亮 马锐 罗文伟 韩朝 李雯

·基础研究·

钙结合蛋白在C57BL/6小鼠内耳细胞发育过程中的表达特点△

田亮 马锐 罗文伟 韩朝 李雯＊

目的探讨在小鼠内耳发育过程中，钙结合蛋白（CB）在内耳耳蜗内的表达是否存在时限性。方法获取C57BL/6小鼠E8开始至出生后一直到成年的内耳标本：E8，E9，E10，E12，E14，E15-E21，D1-D21，成年，进行冷冻切片，进行CB的荧光免疫组织化学染色并观察其在内耳表达的变化情况。结果在C57BL/6小鼠，除了在E16可辨认出螺旋神经元有CB部分表达外，以后直到成年都没有CB的染色表达，而在Scarpa神经元则从E8开始就有表达，其从E19开始先在内毛细胞开始有表达，逐渐在内外毛细胞都有表达，直到成年时表达消失。结论CB在C57BL/6小鼠内耳耳蜗的表达具有时限性，因而可推测出对CB行免疫组织化学染色观察能有效鉴别C57BL/6小鼠及其他动物的再生毛细胞和原有毛细胞，但目前尚无法解释CB一些表达特点的相应机制。（中国眼耳鼻喉科杂志，2013，13：368-371）

钙结合蛋白；C57BL/6鼠；内耳；胚胎发育；免疫组织化学

目前的研究［1］显示，人类耳蜗听毛细胞和螺旋神经元损害后不能再生，这点不同于低等哺乳动物和鸟类［2］。但是，研究者们［3］一直尝试通过各种途径实现毛细胞再生。目前发现：MATH1基因对毛细胞的再生非常重要，过度表达MATH1可在体外诱导支持细胞转化为毛细胞。但是由于尚没有区分再生毛细胞和原有毛细胞的特异性标记物，使实验结果缺乏说服力。钙结合蛋白（calbindin，CB）是细胞内钙离子结合蛋白大家族中的一员。钙离子结合蛋白可能有调节多种神经元功能的作用，包括细胞的生长和分化、细胞骨架的组合、酶的活性、细胞膜的兴奋性和神经递质的释放等重要作用［4］。已有研究［4］证实，在牛蛙中，可以用CB区分再生的毛细胞。本文通过观察C57BL/6小鼠内耳发育过程中CB的表达变化特点，旨在进一步了解CB在其中可能发挥的作用，探讨其是否可用来鉴别C57BL/6小鼠的新生毛细胞。

1 材料与方法

1.1 实验设备和仪器 Leica DMR显微镜（荧光/白光），Leica DFC 300 FX图像采集系统，Leica Qwin V3图像处理系统，Leica DMIRE2共聚焦荧光显微镜，Leica CM3050S冷冻切片机（Leica Microsystems，瑞士）。抗Calbindin小鼠单克隆抗体（ab9481购于英国abcam公司）。Adobe Photoshop 7.0.1图像处理软件。

1.2 孕鼠和新生鼠天数的计算方法 所有动物实验操作均遵守复旦大学动物管理委员会关于动物实验的相关规定。选用C57BL/6种鼠60对（由复旦大学上海医学院实验动物科学部提供），将种鼠雌雄同窝，次日分开，当日下午2～3点记做E1，依次类推从第8天E8开始选取体重变化明显的取胚胎。出生（一般都是晚间生）后第1天，postnatal day1简称PND1=D1，以后依次类推D2，D3......D16；断奶后1天计为d22；成年鼠（孕鼠）记做Da。

1.3 胚胎和新生鼠耳蜗的处理方法 孕鼠经腹腔注入过量的氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉后，剖腹迅速取出子宫，将胚囊剥离出，浸入冰冷的4％多聚甲醛溶液中，浸泡2 h后；在冰冷的4％多聚甲醛中将胚胎剥离出，复浸入4％多聚甲醛溶液中，4℃冰箱放置2 h后；浸入15％的蔗糖溶液中，在4℃冰箱放置1 h，更换30％的蔗糖溶液4℃过夜；然后浸入最佳切削温度（optimal cutting temperature，OCT）包埋剂置4℃冰箱放置2 h。最后将胚胎按照垂直立位摆放在冷冻切片托盘上，用OCT固定。切成10μm薄的冷冻切片放入-20℃冰箱备用，多余的胚胎转入-80℃冰箱保存。对于E14，E15切取头部进行上述处理，E16以后的胚胎将颞骨取出固定，并将耳蜗剥离出来作冷冻切片。新生鼠断头处死，迅速将颞骨取出，去掉脑组织和皮肤后浸入冰冷的4％多聚甲醛溶液中；然后在冰冷的4％多聚甲醛溶液中将耳蜗完整剥离出来，复浸入4％多聚甲醛中在4℃冰箱放置4 h后；根据天数的不同使用10％的EDTA脱钙0～36 h，以后步骤同胚胎（取子宫后的孕鼠断头后同新生鼠处理）。

1.4 Cabindin免疫组织化学染色步骤 载有标本的冷冻切片常温干燥2 h，磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）浸泡10 min；然后使用10％山羊血清孵育20 min，抗CB小鼠单克隆抗体（1∶500）37℃孵育1 h，PBS 5 min冲洗3次；二抗抗小鼠FITC（1∶200）37℃孵育1 h（以后步骤需要避光进行），PBS 5 min冲洗3次，最后用50％甘油和指甲油封片（4℃冰箱内避光保存）。

2 结果

E8～E16没有表达。E18螺旋器原基将发育为内毛细胞的细胞有表达，螺旋器下小管结构出现，沿管壁表达强（图1）。Kollicker器从顶部到底部表达由强到弱的趋势明显，蜗轴有零星细胞表达，螺旋韧带、血管纹都有表达。E19表达CB的内毛细胞清晰可见，Kollicker器的细胞靠近螺旋缘处表达强烈，可以清楚地看出Kollicker器的轮廓。在小上皮嵴与螺旋器之间有一个细胞表达非常清楚。血管纹处外围有零星细胞表达，蜗轴可见纤维丝（图2）。E21表达与E19相似，但是原来在小上皮嵴与螺旋器间表达的细胞未再表达，而是在基底膜下方相对的位置出现了表达的细胞。

图1. E18鼠耳蜗底圈冷冻切片后染色绿色荧光为CB阳性表达，可见螺旋器原基将发育为内毛细胞的细胞有表达，螺旋器下小管结构出现，沿管壁表达强

图2. E19鼠耳蜗底圈冷冻切片染色绿色荧光为CB阳性表达，Kollicker器的细胞靠近螺旋缘处CB表达强烈，可以清楚地看出Kollicker器的轮廓

D1 Kolliker器细胞表达减弱，盖膜表达增强。螺旋器外毛细胞下小管结构表达强烈，此时3排外毛细胞也开始出现较明显表达（图3），Scarpa神经元胞质表达（图4）。D2盖膜表达消失，但盖膜中1/3处下方有表达积聚现象。内外毛细胞同等强度表达，外毛细胞轮廓清晰可见，螺旋器下小管结构位于螺旋器隧道下方，腔隙边缘表达，血管纹有小腔隙强烈表达。D3盖膜无表达，但盖膜中部下方区域表达强烈。血管纹和内外毛细胞表达同前。螺旋器下小管结构表达减弱。D4盖膜无表达，Kollicker器中部表达强烈，范围扩大到内螺旋沟底部，并且出现内螺旋沟开始形成的现象。内外毛细胞表达强烈，螺旋器下小管结构无表达，血管纹表达同前。螺旋神经元无表达，Scarpa神经元仍表达。D5盖膜下表达范围同前，但是Kollicker器组织进一步缩小，盖膜开始抬起。螺旋器下小管结构扩大，但没有表达。内外毛细胞表达清晰，血管纹同前，螺旋神经元无表达。D6同前，但是螺旋器下小管结构有表达。D7盖膜结构清晰可见，螺旋缘骨质部分表达强烈，其余表达同前。D8盖膜几乎完全抬起，Kollicker器进一步萎缩，Scarpa神经元有表达。盖膜上表面开始有表达，前庭膜开始与盖膜分离，余同前。D10盖膜成熟，前庭膜接近与盖膜完全脱离，余表达同前。

图3. D1鼠耳蜗冷冻切片染色绿色荧光为CB阳性表达，较E19相比Kolliker器细胞表达CB减弱，盖膜表达增强。外毛细胞下小管结构表达强烈，外毛细胞表达也很明显

图4. D1鼠耳蜗冷冻切片染色绿色荧光为CB阳性表达，可见CB在Scarpa神经元胞质内有表达

D12螺旋器的各种结构已经发育成熟，螺旋器下小管结构缩小，有表达，血管纹表达减少，内外毛细胞强烈表达。前庭膜无表达，盖膜无表达。螺旋神经元间隙少量表达（图5）。D14同D12，Scarpa仍表达，螺旋神经元间隙少量表达。D16同D14，但内外毛细胞表达开始减弱，螺旋器下小管结构管腔消失、表达减弱，血管纹表达减弱。D22螺旋器下小管消失，遗留一小结节。余同D16，但都进一步表达减弱，外毛细胞减弱比内毛细胞明显，Scarpa神经元仍有部分表达。Da内外毛细胞无表达，仅血管纹有表达，骨螺旋板无表达（图6）。

图5. D12鼠耳蜗顶圈冷冻切片染色绿色荧光为CB阳性表达，此时螺旋器基本发育成熟，螺旋器下小管结构缩小，有表达，内外毛细胞强烈表达。前庭膜无表达，盖膜无表达。螺旋神经元间隙少量表达

图6. Da鼠耳蜗顶圈冷冻切片染色绿色荧光为CB阳性表达，此时内外毛细胞均无表达，仅血管纹有表达，骨螺旋板无表达

3 讨论

CB是细胞内Ca2+结合蛋白大家族中的一员。包含EF Ca2+结合域，与钙调蛋白和肌钙蛋白C有关［5］。CB首先在鸡的小肠中检测到［6］，后在哺乳动物中也发现其在小肠、肾、子宫、胎盘［7］以及内耳细胞中有表达［8］。对哺乳动物的耳蜗进行的研究很多，有豚鼠、猴子、小鼠、大鼠、沙鼠、人、狗和鹿［9］，是耳蜗内研究最多的CB之一［10］，但是各种动物之间表达存在明显的差别。CB在绒猴中主要表达在II型神经元中，而在人类的胚胎螺旋神经元中CB在I型螺旋神经元细胞表达［10］。在成年狗耳蜗，CB在内外毛细胞的静纤毛、表皮板和胞质内有表达［9］。在成年Wistar大鼠耳蜗中的螺旋神经元没有 CB的表达［11］。本研究发现在C57BL/6小鼠除了在E16可以辨认出螺旋神经元有部分表达外，以后直到成年都没有CB的染色表达，而在Scarpa神经元则从开始就有表达。在豚鼠和沙鼠中CB的表达位于内外毛细胞［12］。而在C57BL/6小鼠，从E19开始先在内毛细胞有表达，逐渐在内外细胞都有表达，到成年时表达消失。曾有研究者［13］发现随着时间的推移，鼠的听觉中枢系统中CB的表达也会出现类似的急剧下降。这种表达的差异性，可能是由于在不同物种中所发挥的作用不同所造成的。CB蛋白的作用可能有：①作为Ca2+的缓冲，帮助细胞从各种原因导致的钙离子过载中存活下来。神经元对凋亡的敏感性似乎与CB的表达水平呈反比。CB的过表达抑制了培养中表达presenilin-1突变基因的神经元细胞凋亡；②CB抑制凋亡的特性不只是Ca2+缓冲器的结果，还可能是这种蛋白有抑制caspase-3活性的能力，这种能力不同于CB结合钙离子的特性，而是不依赖Ca2+的作用机制［5］，通过等温滴定热量测定分析的方法已发现在空间构象上Calbindin-D28K可以与caspase-3紧密结合，也许是其抗凋亡的一种重要方式［14］；③CB可能有调节多种神经元功能的作用，包括细胞的生长和分化、细胞骨架的组合、调节酶的活性、调节细胞膜的兴奋性和神经递质的释放［4］。上述3种可能的作用可以来解释CB在C57BL/6小鼠中的表达，尤其对毛细胞内表达更为完善。毛细胞从祖细胞分化而来，涉及细胞的分化，分化为毛细胞后开始进行细胞骨架的组合等变化。目前已发现通过外界给声刺激可以在鸡胚发现CB蛋白阳性表达明显增加，提示其CB可能介入鸟类动物声损伤后的毛细胞自我修复功能机制［15］。而CB在新生毛细胞或未成熟毛细胞中表达的特点同样存在于牛蛙的前庭毛细胞中，且在牛蛙中可用来区分再生的毛细胞［4］。从本实验中观察到的CB在毛细胞中表达的特点，推测可在C57BL/6小鼠中用以鉴别再生的毛细胞与原有的毛细胞。但是在螺旋神经元中为什么E16之后就没有表达了，而在Scarpa神经元中反而持续表达，需要进一步研究。

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Expression characteristics of Calbindin during the inner ear development of C57BL/6m ice

TIAN Liang，MARui，LUOWen-wei，HAN Zhao，LIWen＊.Department of Otolaryngology，Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University，Shanghai 200031，China

HAN Zhao，Email：sfhanzao＠yahoo.com.cn

Objective To explore the timeliness of Calbindin expression during the inner ear development of C57BL/6Jmice.Methods We obtained inner ear specimens from precise pregnancy C57BL/6Jmice（E8，E9，E10，E12，E14，E15～E21）and postnatal mice（D1～D22）.All of the specimens were cyro-sectioned and marked by the Calbindin antibody.The distribution of Calbindin was observed during the inner ear development under a fluorescence microscope.Results In the spiral ganglion neurons，the expression of Calbindin only existed at E16 and then disappeared，but the expression began at E8 and continued until adulthood in Scarpa ganglion neurons.The expression of Calbindin began at inner hair cells from E19，step by step diffused to both inner hair cells and outer hair cells over time.However，it disappeared after birth.Conclusions The timeliness of Calbindin expression during inner ear development of C57BL/6Jmice is confirmed。Calbindin is suggested to be useful for distinguishing regenerative hair cells from original hair cells in C57BL/6Jmice.However，we can not explain the mechanisms of some Calbindin expression characteristics during inner ear development of C57BL/6 mice.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：368-371）

Calbindin；C57BL/6 mice；Inner ear；Embryo development；Immunohistochemistry

2012-11-01）

（本文编辑 杨美琴）

国家自然科学基金项目（81271084）

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科＊实验中心 上海 200031

韩朝（Email：sfhanzao＠yahoo.com.cn）