酶解制备菜籽蛋白肽条件的优化

易起达，王茜茜，王立峰，高瑀珑，袁 建，鞠兴荣*

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023)

酶解制备菜籽蛋白肽条件的优化

易起达，王茜茜，王立峰，高瑀珑，袁 建，鞠兴荣*

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023)

选用碱性蛋白酶Alcalase对菜籽蛋白进行水解。在单因素试验研究不同处理条件对菜籽蛋白水解度和菜籽蛋白肽得率的影响的基础上，建立单因素对菜籽蛋白肽水解度影响的数学模型，通过响应面分析对酶解条件进行优化。确定菜籽蛋白酶解最佳工艺条件为：底物质量分数为4.49%、pH8.45、温度55℃、酶解时间180min、加酶量5000U/g pro，在该优化条件下，菜籽蛋白水解度理论值可达15.00%，实际值为14.71%。

菜籽蛋白肽；碱性蛋白酶Alcalase；水解度；响应面分析

我国油菜种植面积和总产量均长期居世界第一位，占世界油菜种植面积和总产量的30%左右[1]，油菜籽中的菜籽蛋白为完全蛋白质，几乎不存在限制氨基酸，从蛋白质氨基酸组成来看，必需氨基酸组成极为均衡，约占氨基酸总量的37%～38%[2]。菜籽肽是以菜籽蛋白为原料通过其降解得到的一种低分子肽混合物，与其他植物蛋白相比具有明显营养互补优势[3]。菜籽蛋白水解得到的多肽不仅具有良好的低黏度、酸溶性、抗凝胶形成性，而且在体内消化吸收快，蛋白质利用效率高[4]。菜籽蛋白肽具有低抗原性和良好的生理活性，能够避免过敏性反应。目前国内外已有研究表明，菜籽蛋白经过降解所形成的菜籽肽具有降血压[5]、抗氧化[6-7]、抗肿瘤[8-9]、促细胞生长[10]等多种生物活性，在医药、食品等领域具有广阔的应用开发前景。

菜籽粕经碱溶酸沉法提取菜籽蛋白，然后制备菜籽肽，可以有效去除非蛋白杂质成分，得到纯度较高的菜籽肽。但是这种方法的主要缺陷是蛋白提取过程有蛋白损失。蛋白在酶解时浓度较高，水解产物在酶的作用下会进一步聚集，水解度不高，得率较低，从而造成生产成本上升[11]。碱性蛋白酶Alcalase作为一种内切蛋白酶，主要用于水解各种蛋白质，该酶的酶解效率高，且具有高度的操作安全性[12]。本研究中，采用碱性蛋白酶Alcalase对菜籽蛋白酶解， 选定酶解pH值、加酶量和底物质量分数进行三因素三水平中心组合试验，通过Design Expert7.0软件进行响应面分析，得出最佳工艺参数，为菜籽肽的工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

国产普通双低油菜籽 益海嘉里公司。

碱性蛋白酶(Alcalase液态，酶活力≥2.4AU/g) 美国Sigma公司；甲醇、氢氧化钠、盐酸、硼酸、硫氰酸铵、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化亚铁(均为分析纯) 南京化学试剂厂。

LXJ-离心沉淀机 上海医用仪器厂；722N 紫外-可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；PHS-3C型精密数显pH计 上海精密科学仪器厂；TDL-5-A 型离心机 上海安亭科学仪器厂；ALpHA2-4 型真空冷冻干燥机 德国Christ公司；可调电热板 北京科伟永兴仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 样品的制备

油菜籽经砻谷机碾压脱壳、粉碎，于索氏抽提装置中使用石油醚经24h抽提脱油，室温晾干除去溶剂得到菜籽粕；粉碎过60目筛并将菜籽粕以1:20(m/V)加水分散于蒸馏水中，50℃条件下搅拌2h，其间用2mol/L的NaOH溶液调节使pH值维持11，离心，得到上层清液；在下层残渣中加入10倍pH11的蒸馏水，按上法再次提取合并提取的上清液，用1mol/L的盐酸调节pH值至4.5使蛋白质等电点沉淀，静置1h后3000hg离心30min，得沉淀蛋白，菜籽蛋白(蛋白质含量83.07%)，用无水乙醇脱色处理1～2遍，冷冻干燥，收集备用。

1.3 Alcalase 酶解菜籽蛋白

准确称取一定质量的菜籽蛋白加入到反应容器中，调节混合物的温度、pH值和底物质量分数，加入Alcalase蛋白酶到容器中，开始计时，同时在水解过程中加入4mol/L的NaOH维持pH值恒定。反应结束后将水解物100℃加热10min钝化蛋白酶，待其自然冷却后以4000hg离心10min，收集上清液，置冰箱中待用。

1.4 测定方法

1.4.1 蛋白质水解度(DH)测定

采用pH-Stat法[13]。

式中：c为NaOH的浓度/(mol/L)；V为NaOH消耗的体积/mL；a为样品分离蛋白氨基平均解离度；m为蛋白质质量/g；h为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数(取h=718mmol/g)。

1.4.2 多肽得率的测定

三氯乙酸(TCA)作为蛋白质沉淀剂，可以沉淀蛋白质及肽段。蛋白质肽链随着水解反应的进行被切成大小不等的片段，三氯乙酸溶解指数越高，表明较短肽段的含量越高[14-15]。

将蛋白沉淀用2倍体积水洗一次，同样条件离心并合并上清液。取上清液10mL测定其蛋白质含量；另取10mL上清液加入10mL TCA溶液，其余上清液冷冻干燥成固体备用。摇匀，静置1h，4000hg离心20min，取上清测定蛋白质含量并计算菜籽蛋白肽得率。

多肽得率/% =

1.4.3 蛋白酶活力的测定

采用福林-酚法[16-17]。

1.4.4 蛋白质含量的测定

参照GB 5009.5ü2010《食品中蛋白质的测定》方法。

1.5 单因素试验

本实验在碱性蛋白酶Alaclase生产菜籽肽基础上，分别考察pH值、酶解时间、底物质量分数、加酶量和酶解温度对蛋白水解度和多肽得率的影响，分别进行单因素试验，确定最佳的因素水平。

1.6 响应面法分析优化

通过单因素试验结果确定影响碱性蛋白酶酶解效果的主要因素，再根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，利用Design Expert7.0软件对实验进行设计和数据处理，得出菜籽肽最佳酶解工艺条件，并进行验证实验检验模型预测的有效性。

1.7 数据处理

2 结果与分析

2.1 酶解pH值对蛋白水解度和多肽得率的影响

图 1 pH值对蛋白水解度和多肽得率的影响Fig.1 Effect of pH on hydrolysis degree and peptide yield

取加酶量为3000U/g pro、温度50℃、底物质量分数5%、时间3h。分别取pH7.0、8.0、8.5、9.0、10.0进行水解，测定DH和多肽得率。由图1可知，pH值从7.0到10.0的过程中，DH和多肽得率先增大后减小，在pH8.5时，两指标达到峰值。

2.2 酶解时间对蛋白水解度和多肽得率的影响

取加酶量为3000U/g pro、温度50℃、底物质量分数5%、pH8.5。分别进行水解各1、2、3、4、5h，测定DH和多肽得率。图2表明酶解时间在3h内时，菜籽肽的得率是随着时间的增加而增加的，超过3h后菜籽肽的得率开始呈现下降趋势；水解度则一直呈上升趋势。产生这种现象的原因为，在一定的时间内，蛋白得到充分的酶解，都以小肽的形式存在于上清液中；酶解时间在大于3h 后，酶解液体系内的产物增加到一定浓度，反而对酶的活力产生抑制作用，使籽肽得率下降。

图 2 酶解时间对蛋白水解度和多肽得率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and peptide yield

2.3 底物质量分数对蛋白水解度和多肽得率的影响

图 3 底物质量分数对蛋白水解度和多肽得率的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and peptide yield

取加酶量为3000U/g pro、温度50℃、pH8.5、酶解时间3h。以蛋白质质量为基础，分别配制成底物质量分数为2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%的溶液水解。测定DH和菜籽肽得率。由图3可知，随着底物质量分数的增大，DH和菜籽肽得率都呈现下降的趋势，但菜籽肽得率受影响较大，水解度受影响较小。当底物质量分数大于5%时，下降趋势明显，这可能是因为随着底物质量分数的增大，造成酶解液黏度增大，酶解液体系整体水分含量降低，影响蛋白酶扩散，从而降低水分活度，对水解反应产生抑制作用。所以，底物质量分数选定为5%较为合适。

2.4 加酶量对蛋白水解度和多肽得率的影响

图 4 加酶量对蛋白水解度和多肽得率的影响Fig.4 Effect of enzyme concentration on hydrolysis degree and peptide yield

分别取酶量为1000、2000、3000、4000、5000U/g pro在温度50℃、pH8.5、底物质量分数5%、酶解时间3h条件下进行水解，测定DH和多肽得率。结果如图4所示。水解度随着酶用量的增加而增加，这表明酶与底物结合的几率随着酶用量的增加而逐步增加，进而水解度增加。但是当酶用量大于3000U/g pro后，增加的效果已不太明显，且考虑到酶试剂自身价格较为昂贵，过量添加增加成本，故本实验选取酶用量为3000U/g pro。

2.5 酶解温度对蛋白水解度和多肽得率的影响

图 5 酶解温度对蛋白水解度和多肽得率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree and peptide yield

取加酶量3000U/g pro、底物质量分数5%、pH8.5、酶解时间3h。以40、45、50、55、60℃进行酶解，测定蛋白DH和菜籽肽得率。由图5可知，酶解温度对DH和多肽得率的影响显著，55℃为较理想的酶解温度。温度继续上升，菜籽肽得率与水解度反而下降，这是因为温度过高可能导致碱性蛋白酶Alcalase自身分子结构部分解体，导致碱性蛋白酶变性，从而使其酶活力降低所造成的。

2.6 响应面优化试验

根据单因素试验结果，菜籽肽得率与水解度反应的趋势基本一致，从经济因素及工作量方面考虑，故仅选取菜籽蛋白DH(Y)作为响应值。同时选取了对菜籽蛋白DH变化影响较大的3个因素，即酶解pH值、加酶量和底物质量分数，分别将其标记为自变量X1、X2和X3，每一个自变量按低、中、高3个水平分别以—1、0、1进行编码。采用Box-Behnken中心组合试验设计，各因素及水平编码如表1所示。

表 1 Box-Behnken中心组合试验设计因素水平及编码Table 1 Coded values and corresponding values of the optimization parameters used in response surface analysis

为了最优拟合二次多项回归方程各项系数，依据统计学试验设计要求，对影响菜籽蛋白DH的关键内在因素进行15组试验，其中12组析因试验，3组为零点试验，用以估计试验误差，试验设计及结果见表2。

表 2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and results for response surface analysis

利用Design Expert 7.0软件对表2试验数据进行多元回归拟合，选择对响应值显著的各项，可得酶解pH值、加酶量及底物质量分数与菜籽蛋白水解度的二次多项回归方程：

对该回归方程进行方差分析和显著性检验，结果见表3和表4。

表 3 菜籽蛋白DH二次多项式拟合模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the fi tted quadratic polynomial model for hydrolysis degree

由表3中二次多项式拟合模型进行方差分析表明，本实验所选用DH模型具有高度的显著性(P＜0.01)，模型预测值与实际值不拟合的概率用模型失拟项表示，失拟项在α=0.05水平上不显著(P＞0.05)，表明该模型不必引入更高次数项，模型选择合理；Y的变异系数较低(2.96%)，表明实验操作可信；模型校正决定系数为0.9414，存在显著性差异，同时模型的相关系数R2为0.9744，大于0.9，表明该模型拟合优度良好。因此该模型可以用来分析DH随酶解pH值、加酶量和底物质量分数的变化。从表4可知，X1、X2、X3的Prob＞F值分别为0.0206、＜0.0001、 0.0007，所以3个因素中对DH的影响效果最大的为加酶量，底物质量分数的影响次之，酶解pH值的最小。

表 4 菜籽蛋白DH回归方程系数显著性检验结果Table 4 Statistical signif i cance of regression coeff i cients in the fi tted quadratic polynomial model for hydrolysis degree

2.7 模型验证性实验

通过Design-Expert软件的预测分析功能，在DH取最大值，加酶量尽量少的条件下，得到菜籽蛋白酶解最佳工艺条件为：pH8.45、温度55℃、加酶量5000U/g pro、底物质量分数4.49%、酶解时间180min，蛋白质水解度为15.00%。根据Box-Behnken中心组合试验和二次多项回归方程分析结果，此条件下实际所得菜籽肽得率为73.02%，菜籽蛋白水解度为14.71%，这与模型预测值(15.00%)仅偏差1.93%，较为接近，说明该模型能够较好地预测实际的酶解情况，所以响应面分析法应用于菜籽肽酶解条件的优化是可靠的。

3结 论

本实验以菜籽蛋白DH、多肽得率为评价指标，初步研究了碱性蛋白酶Alcalace酶解菜籽蛋白的相关条件，并以菜籽蛋白DH为响应值，应用响应面分析法优化了菜籽蛋白酶解条件。通过单因素试验，确定酶解pH值、加酶量和底物质量分数对DH有显著影响，在此基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理采用响应面分析实验，对实验结果进行分析比较：得到菜籽蛋白酶解最佳工艺条件为：pH8.45、温度55℃、加酶量5000U/g pro、底物质量分数4.49%、酶解时间为180min，在该优化条件下，菜籽蛋白DH理论可达15.00%，模型验证实验DH实际可达14.71%，菜籽肽得率为73.02%。

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Optimization of Enzymatic Preparation of Rapeseed Peptides

YI Qi-da，WANG Xi-xi，WANG Li-feng，GAO Yu-long，YUAN Jian，JU Xing-rong*
(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

Rapeseed protein was extracted from defatted rapeseeds and hydrolyzed by alcalase. Response surface methodology was employed to optimize enzymatic hydrolysis conditions based on degree of hydrolysis (DH) and rapeseed peptide yield. The optimum conditions for enzymatic preparation of rapeseed peptides were found to be hydrolysis at 55 ℃and pH 8.45 for 180 min with a substrate concentration of 4.49% and an enzyme concentration of 5000 U/g protein. Under these conditions, the theoretical value of degree of hydrolysis was 15.00%, while the actual value was 14.71%.

rapeseed peptides；alcalase；degree of hydrolysis；response surface analysis

TS201.2

A

1002-6630(2013)01-0166-05

2012-09-30

国家农业成果转化基金项目(2012GB24490611；2011GB2C100012)；江苏省科技支撑计划项目(BE2011386)；十二五国家科技支撑计划项目(2012BAD37B08)

易起达(1987ü)，男，硕士研究生，研究方向为食品加工与营养。E-mail：yi.qida@yahoo.com.cn

*通信作者：鞠兴荣(1957ü)，男，教授，博士，研究方向为食品营养及功能性成分开发。E-mail：xingrongju@163.com