具有胆盐水解酶活性的乳酸菌对高血脂症大鼠血脂的调节作用

王俊国，孟和毕力格，包秋华，丹 彤，王丽凤，张和平*

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

具有胆盐水解酶活性的乳酸菌对高血脂症大鼠血脂的调节作用

王俊国，孟和毕力格，包秋华，丹 彤，王丽凤，张和平*

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

目的：筛选出具有胆盐水解酶活性的乳酸菌，并通过动物实验验证其降血脂的效果。方法：通过琼脂平板测试法和高效液相色谱法(HPLC)对乳杆菌胆盐水解酶活力进行定性和定量测试，筛选出具有胆盐水解酶活性的乳杆菌灌胃高脂血症大鼠；将雄性Wistar大鼠24只按体质量约相等分为正常对照组、高脂模型组及实验组，后两组给予高脂饲料喂养，并每日一次给这3组分别灌胃0.9%生理盐水、脱脂乳和活菌制剂，28d后测定相关指标。结果：L. fermentum MGH13-1具有较高的胆盐水解酶活性，将其灌胃大鼠后，实验组血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯等含量明显低于高脂模型组(P＜0.05)，肝脏中的胆固醇含量明显低于高脂模型组(P＜0.05)，粪便中的胆固醇、胆酸及短链脂肪酸含量明显高于高脂模型组(P＜0.05)。结论：具有胆盐水解酶活性的L. fermentum MGH13-1对高脂血症大鼠有明显的降血脂作用。

乳酸菌；L. fermentum MGH13-1；胆盐水解酶；高脂血症大鼠；降血脂作用

血液中过高的胆固醇含量是引起冠心病和心脑血管疾病的主要原因[1]。据世界卫生组织预测，到2020年，在所有因病死亡的人数中约有40%人死于高胆固醇引起的疾病[2]。研究发现经常食用一些益生菌(主要是乳酸菌)的发酵制品及其制剂有助于降低血液胆固醇的含量[3-5]。近年来许多研究表明乳酸菌降低血液胆固醇与该乳酸菌产生的胆盐水解酶(bile salt hydrolase，BSH)活力密切相关[6-7]。

胆盐水解酶是微生物生长、繁殖过程中产生的一种代谢产物。该酶主要由乳酸菌产生，能水解结合态牛磺酸胆盐和甘氨酸胆盐，将其转变成氨基酸和游离胆酸[6]。在人体内，胆盐的排泄是体内消除胆固醇的主要途径，也是胆固醇代谢的重要方式。胆盐水解酶在肝肠循环中可将结合胆酸盐降解为游离胆酸，而游离胆酸在体内溶解性很低，从而促进了胆盐的排泄[8]。为了弥补胆盐的损失，维持正常的肝肠循环就必须有部分胆固醇合成新的胆盐来补充排泄掉的那部分(胆固醇是胆盐的前体物质)，从而起到降低血液胆固醇的作用[6-7]。

在20世纪70年代，人们就已在几种肠道固有的乳酸菌中发现了胆盐水解酶，并提出其与降低胆固醇有关的观点[9-10]，而后来的研究进一步证实了这一观点，口服含有胆盐水解酶活性的乳酸菌确实可以降低动物体内血清胆固醇的水平[11-13]。人们越来越关注胆酸盐水解酶和乳酸菌降胆固醇之间的关系，在菌株的筛选上，是否具有胆酸盐水解酶活性已成为一个重要的指标[6]。

本研究的目的在于从分离自蒙古国传统发酵乳制品中的7株乳杆菌中筛选出具有胆盐水解酶活性的乳杆菌菌株，并通过动物实验检验其降血脂的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从蒙古国传统发酵乳制品中筛选出的7株耐酸性、耐胆盐较好的菌株：MGH2-1-1、MGH7-2、MGH13-1、MGH15-1、MGH17-2b、MGH16-1、MGH14-1。以上菌株由内蒙古农业大学食品科学与工程学院乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

MRS培养基、10%脱脂乳培养基、BCP琼脂培养基，按文献[14]提供方法配制；氯化钙、甲醇、巯基乙酸钠、二硫苏糖醇、冰醋酸 上海国药集团化学试剂有限公司；脱氧牛磺胆酸钠(分析纯)、甘氨胆酸钠(分析纯)、甘氨酸(色谱纯) 美国Sigma公司；总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司；总胆汁酸试剂盒 英国Ranbox公司。

1.2 实验动物

体质量约为120～140g的5周龄雄性Wistar系大鼠24只，由内蒙古大学实验动物研究中心提供。

1.3 仪器与设备

HA-300M 型全自动高压灭菌器 日本Hirayama公司；GS-15R 型离心机 美国Beckman公司；STACS45F恒温培养箱 日本三洋公司；BBL厌氧培养罐日本东化学株式会社；Agilent 1100 HPLC系统(配Sep-PakC18柱和可变波长紫外检测器) 美国Agilent公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的活化

将在脱脂乳培养基中冷冻干燥保存的供试菌株在MRS液体培养基中活化3代。

1.4.2 胆盐水解酶活力的定性检测[15]

在MRS液体培养基中添加0.3%脱氧牛磺胆酸钠(TDCA)、0.2%巯基乙酸钠(THIO)、0.37g/L CaCl2和1.5%琼脂；121℃ 15min灭菌后倾倒入灭菌平皿中，凝固后倒置放入厌氧罐(BBL)中48h后取出。将无菌滤纸片放入平皿中，在每个滤纸片上滴加10μL菌液，平皿再次放入厌氧罐中，37℃培养72h。观察滤纸片周围有无白色沉淀物生成。

1.4.3 胆盐水解酶活力的定量检测[15]

将供试菌株，按2%接种量接种于含有0.3%甘氨胆酸钠的200mL MRS-THIO培养基中，37℃培养24h后，通过HPLC测BSH活力。BSH的活力以菌株在24h培养后每升培养液中所含的游离甘氨酸的毫摩尔数表示，单位是mmol/L，同时选取未接菌的空白培养基作为对照。

HPLC色谱条件：Agilent 1100 HPLC系统：装配 Sep-PakC18(100mmh8mm)柱，荧光检测波长205nm，进样量为20μL，峰面积计算用ChemResearch Software，样品的流速1.0mL/min，所用有机溶剂均为色谱纯。

流动相：700mL甲醇和300mL 0.02mol/L乙酸混合，用5mol/L NaOH调其pH值为5.6，通过0.45μm聚丙烯过滤器过滤。

配制2.00mmol/L甘氨酸的溶液，作为标样，并稀释至0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mmol/L，利用HPLC法测定甘氨酸含量。HPLC条件与样品相同，以甘氨酸浓度为横坐标(x，mmol/L)，峰面积为纵坐标(y, mAU)，绘制标准曲线y=949.66x(R2=1)。

1.4.4 动物实验菌株的制备

将筛选出的具有胆盐水解酶活性的乳杆菌菌株接种于MRS培养基，37℃培养18h，经离心(3000hg，10min)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤后，加入10%灭菌脱脂乳，并调整其菌数约为2.0h109CFU/mL，混匀后用BCP琼脂培养基倾注培养，计活菌数确认。将菌体脱脂乳悬液按每日使用量分装于冷冻瓶中，置—85℃冰柜保存备用。

1.4.5 实验动物分组及饲养方式

将Wistar系大白鼠购进后，水和营养饲料自由采食饲喂至第7天。在第7天称体质量后，按每个实验组平均体质量约相等分为正常对照组、高脂血症模型组(模型组)、实验组(乳酸菌组)，每组8只大鼠。对照组喂以标准饲料(22%酪蛋白、47%玉米淀粉、2.2%纤维素、1.1%维生素、3.7%矿物质混合物、24%蔗糖)，模型组、实验组均喂以在标准饲料中添加1%胆固醇、10%猪油及0.2%胆酸钠的高脂饲料，每组分别按2mL/只灌胃，分组及灌胃情况具体如表1所示。

表 1 实验大鼠灌胃成分设计(n=8)Table 1 Grouping and administration of rats(n=8)

1.4.6 样品采集与分析测试

末次给药后(即实验第28天)将大鼠禁食一夜，心脏采血后致死，无菌操作台中解剖，取出肝脏样品冷冻保藏。血液经离心(3000hg，10min)分离血清，用全自动生化分析仪测定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量；将实验最后3d随机收集的大鼠粪便进行冷冻干燥处理后，分别取粪便及肝脏样品，用甲醇-氯仿混合液(体积比2:1)，45℃水浴提取 1h，8000hg离心10min后，用邻苯二甲醛比色法测定胆固醇含量[16]；取冷冻干燥后粪便样品0.3g，加入3mL去离子水于研磨器中进行研磨，完全磨碎后离心(3000hg，10min)后，取上清液分为两份，其中一份在全自动生化分析仪上，用总胆汁酸测定试剂盒(Randox, BI1689/S)测定粪便中胆汁酸含量[17]；另一份上清液中加入同体积的氯仿混合后离心(8000hg，10min)，取上清液通过HPLC测定粪便中的短链脂肪酸[17]。Agilent 1100 HPLC系统，装配Zorbax SB C18柱，柱温：65℃；荧光检测波长：220nm；进样量：20μL；流动相：0.025mol/L磷酸；流速：0.6mL/min。

1.4.7 数据统计

应用SPSS12.0系统统计软件对各实验数据进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 胆盐水解酶活性的定性检测结果

在7株实验菌株中，仅有MGH13-1在滤纸片周围产生明显的白色沉淀，见图1。当具有胆盐水解酶活性的乳酸菌在含有脱氧牛磺胆酸钠的培养基中生长时，可以将结合胆盐分解为游离胆酸，而培养基中添加的CaCl2与游离胆酸反应，产生白色沉淀。因此，推断MGH13-1具有胆盐水解酶活性。

利用16S rDNA序列同源性分析对这株菌进行了鉴定，结果显示MGH13-1是发酵乳杆菌(L. fermentum)，在GenBank序列注册号是FJ640989。

图 1 乳杆菌胆盐水解酶活力的检测Fig.1 BSH activity of strain MGH13-1

2.2 胆盐水解酶活性的定量检测结果

图 2 利用HPLC法对菌株胆盐水解酶活力的测定Fig.2 HPLC analysis of glycine produced from bile salt hydrolysis by strain MGH13-1

由图2可知，用HPLC法测定出MGH13-1产生的峰面积是298.4350mAU。根据1.4.3节标准曲线得到对应的甘氨酸浓度是0.3143mmol/L，即其胆盐水解酶活力为0.3143mmol/L。

通过HPLC对其余6株菌的胆盐水解酶活性进行了检测，结果显示这些菌株水解胆盐产生的甘氨酸含量极低，表明它们的胆盐水解酶活性较弱(数据未显示)。这也进一步证实了利用琼脂平板测试法筛选具有胆盐水解酶活性菌株的准确性。

2.3 灌胃L. fermentum MGH13-1对高脂血症大鼠血脂的影响

图 3 灌胃对高血脂症大鼠血脂的影响Fig.3 Effect of L. fermentum MGH13-1 on serum TC, TG, HDL-C and LDL-C in hyperlipidemic rats

如图3所示，与正常对照组比，模型组动物TC、TG、LDL-C明显升高(P＜0.05)，说明高脂血症动物模型建立成功；与模型组比，实验组动物TC、TG、LDL-C明显降低(P＜0.05)表明灌胃菌株对高脂血症大鼠有一定的降血脂作用；实验组动物的TC、TG、LDL-C明显高于正常对照组(P＜0.05)，这表明给高脂血症大鼠灌胃菌株L. fermentum MGH13-1虽然能在一定程度上降低血脂浓度，但是不能完全恢复到正常状态。同时注意到HDL-C的浓度在不同组间没有明显变化。

2.4 灌胃L. fermentum MGH13-1对高脂血症大鼠肝脏及粪便中TC含量的影响

图 4 灌胃L. fermentum MGH13-1 对高脂血症大鼠肝脏中TC含量的影响Fig.4 Effect of L. fermentum MGH13-1 on liver TC in hyperlipidemic rats

由图4、5可知，与正常对照组相比，模型组与实验组的肝脏及粪便中胆固醇的含量显著增加(P＜0.05)，说明饮食来源中过多胆固醇会在肝脏内大量贮存，同时无法被吸收利用的过多胆固醇会随粪便被部分排出体外；与模型组相比，实验组可以显著降低肝脏中胆固醇的含量(P＜0.05)，这表明L. fermentum MGH13-1可以减少胆固醇在肝脏中的积存；与模型组相比，实验组粪便中胆固醇的含量显著增加(P＜0.05)，这说明灌胃L. fermentum MGH13-1可以促进体内胆固醇的排泄。

图 5 灌胃L. fermentum MGH13-1 对高脂血症大鼠粪便中TC含量的影响Fig.5 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal TC in hyperlipidemic rats

2.5 灌胃L. fermentum MGH13-1对高脂血症大鼠粪便中胆酸及短链脂肪酸含量的影响

图 6 灌胃L. fermentum MGH13-1 对高脂血症大鼠粪便中总胆酸含量的影响Fig.6 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal TBA in hyperlipidemic rats

由图6可知，灌胃含有BSH活性的乳酸菌菌株，其粪便中游离胆酸含量高于模型组及正常对照组，差异显著(P＜0.05)，这表明L. fermentum MGH13-1产生的胆盐水解酶有可能将体内的结合胆盐水解成游离胆酸，后者因溶解度低，在体内沉淀并随粪便排出体外；同时模型组粪便中游离胆酸含量高于正常对照组，差异显著(P＜0.05)，推测可能是因为模型组大鼠饲料中含有大量胆固醇及胆酸盐，体内为了调节胆固醇的代谢，其合成和分泌的胆盐量也相应增加，从而也促进了胆盐的代谢，故导致粪便中胆酸含量增加。

表 2 灌胃L. fermentum MGH13-1 对高脂血症大鼠粪便中短链脂肪酸的影响(±s, n＝8)Table 2 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal SCFA in hyperlipidemic rats(±s, n＝8)

表 2 灌胃L. fermentum MGH13-1 对高脂血症大鼠粪便中短链脂肪酸的影响(±s, n＝8)Table 2 Effect of L. fermentum MGH13-1 on fecal SCFA in hyperlipidemic rats(±s, n＝8)

注：表中数据以粪便干质量计。

45.86f2.19b7.15f0.23a丁酸4.89f0.31a3.16f0.21b3.51f0.15b短链脂肪酸正常对照组模型组实验组乙酸丙酸53.81f3.02a6.44f0.23b43.52f3.11b5.11f0.58c

与模型组相比，正常对照组显示出粪便中含有较高浓度的短链脂肪酸(表2)，这表明高脂饲料有可能引起了体内微生物环境的改变，从而影响了有机酸的产生；与模型组相比，实验组可以显著增加粪便中短链脂肪酸的含量(P＜0.05)，特别是丙酸；这表明灌胃L. fermentum MGH13-1可以促进体内肠道短链脂肪酸的产生。

3 讨 论

Patel等[6]认为具有胆盐水解酶活性的益生菌降胆固醇的能力高于没有胆盐水解酶活性的益生菌，因此从降低胆固醇的目的出发，如何准确地筛选出具有BHS活性的乳酸菌是非常重要的。自从Dashkevicz等[18]提出利用琼脂平板法检测乳杆菌的胆盐水解酶后，许多研究者逐步完善了这一方法，并成功地对具有BHS活性的乳酸菌进行了体外定性筛选[15,19]。利用HPLC法对BHS活性的定量检测也被大量研究者证实是准确和可靠的[15,19]。本实验发现在琼脂平板上产生沉淀圈的菌株，利用HPLC测得的甘氨酸浓度也高，相反没有产生沉淀圈的，测得的甘氨酸浓度极低。因此通过对7株乳杆菌的检测也进一步证实了这两种方法的可靠性。

Elkins[20]、Maire[21]认为有胆盐水解酶活力的菌株必须来源于富含有胆盐的环境，例如分离自人或动物的肠道或粪便，而通过实验证实分离自发酵乳制品的菌株也具有胆盐水解酶活力，与本实验的结果相似，Mathara[22]、Maragkoudakis[23]等从发酵乳制品这种非胆盐环境中分离出了具有胆盐水解酶活性的乳酸菌，所以认为具有胆盐水解酶活力的菌株并不一定要来自富含胆盐的环境。

人们通常认为血清中高浓度的TC与LDL-C是引起心血管疾病的主要因素，降低高胆固醇人群的TC与LDL-C浓度可以减少心血管疾病的发病率。通过给大鼠灌胃L. fermentum MGH13-1能使高脂血症大鼠的TC、TG、LDL-C含量明显降低(P＜0.05)，这说明其具有较好的降血脂作用，许多研究者也曾得到过类似的结论[2-4]。尽管有研究显示灌胃乳酸菌可以使HDL-C升高[24-25]，但在本实验中灌胃L. fermentum MGH13-1并没有使HDL-C发生明显的变化，类似的动物实验结果被许多研究者报道过[3,26]。

与正常对照组相比，饲喂高脂饲料可以使大鼠体内肝脏胆固醇含量显著增加(P＜0.05)，而灌胃L. fermentum MGH13-1后可以显著降低肝脏中胆固醇的含量(P＜0.05)。这表明L. fermentum MGH13-1确实可以降低高血脂症大鼠体内的胆固醇，而不是简单地将胆固醇从血液转移到肝脏中。

与模型组相比，实验组粪便中胆固醇的含量显著增加(P＜0.05)，导致这种现象的可能原因主要有：乳酸菌直接将胆固醇吸收或吸附在菌体上并随粪便排出体外；或乳酸菌产生的胆盐水解酶在肠道内将结合胆盐变为游离胆盐，游离胆盐的增多使胆固醇在肠道的吸收率下降，导致粪便中胆固醇增多[7]。在本实验中，对粪便中胆酸进行了测定，发现灌胃L. fermentum MGH13-1会明显增加粪便中胆酸含量(P＜0.05)，这表明L. fermentum MGH13-1利用胆盐水解酶将结合胆盐变为游离胆盐，由于游离胆盐的乳化性能较低，这导致体内胆固醇等脂溶性物质的吸收量下降并随粪便排出体外，此外，通过前期体外实验也发现L. fermentum MGH13-1降低培养基中胆固醇的主要原因是由于在低pH值下胆固醇与游离胆酸共同沉淀的结果，据此认为由于L. fermentum MGH13-1利用胆盐水解酶将结合胆盐变为游离胆盐，游离胆盐的增多使胆固醇在肠道的吸收率下降，从而导致实验组粪便中胆固醇含量的显著增加。

L. fermentum MGH13-1含有的胆盐水解酶对体内血脂的代谢有着重要意义。灌胃L. fermentum MGH13-1会明显增加粪便中胆酸含量(P＜0.05)，这表明胆盐水解酶可将体内的结合胆盐水解为游离胆盐，而在肠道中游离胆盐的溶解性较低，导致其随粪便一起排出体外，为弥补损失的胆盐，体内将有一定量的胆固醇重新合成胆盐，进而降低了体内的胆固醇[6]；同时由于游离胆盐的乳化性能较低，这导致体内胆固醇等脂溶性物质的吸收量下降并随粪便排出体外[7]，从而也起到了体内降低血脂的作用。

与模型组相比，灌胃L. fermentum MGH13-1可以显著增加粪便中的短链脂肪酸含量(P＜0.05)，特别是丙酸含量。研究[7]发现益生菌可以在体内发酵一些膳食纤维导致短链脂肪酸的增加，而短链脂肪酸特别是丙酸可以通过抑制肝脏胆固醇的合成或通过将血液和肝脏的胆固醇重新分配，达到降低血液胆固醇的目的。有研究[27-29]指出丙酸能够抑制肝脏中脂肪酸及胆固醇的合成，而肝脏为了维持正常的生理机能，只能从血液中摄取胆固醇等脂类，因此可以降低体内血脂的含量。因此推断L. fermentum MGH13-1可能在肠道内定殖，发酵食物中的碳水化合物导致肠道中短链脂肪酸的增多，丙酸的增加抑制了肝脏胆固醇及脂肪酸的合成，这也是导致了肝脏及血液中胆固醇含量减少的一个原因。

综合以上结果可知，经体外筛选具有胆盐水解酶活性的L. fermentum MGH13-1对患有高脂血症大鼠有显著的降血脂作用，其可能通过多种途径达到降低体内血脂的效果。从本实验看出L. fermentum MGH13-1降血脂与其具有胆盐水解酶活性之间有着密切联系，同时对于菌株L. fermentum MGH13-1而言，体内短链脂肪酸特别是丙酸的增加对乳酸菌降低胆固醇也有着很大意义。其详细的降胆固醇机制还需要进一步研究。

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[29] WANG Junguo, ZHANG Heping, CHEN Xia, et al. Selection of potential probiotic lactobacilli for cholesterol-lowering property and their effect on cholesterol metabolism in rats fed on a high lipid diet[J]. J Dairy Sci, 2012, 95(4): 1645-1654.

Hypolipidemic Effect of Lactobacillus with Bile Salt Hydrolase Activity in Hyperlipidemic Rats

WANG Jun-guo，MENGHE Bilige，BAO Qiu-hua，DAN Tong，WANG Li-feng，ZHANG He-ping*
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China)

Objective: To screen Lactobacillus with bile salt hydrolase (BSH) activity and to explore its hypolipidemic effect in hyperlipidemic rats. Methods: Agar plate assay and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used to detect and quantify bile salt hydrolase activity in Lactobacillus. Lactobacillus with excellent BSH activity was administrated by gavage to hyperlipidemic rats. Twenty-four male Wistar rats of similar body weight were divided into normal control, hyperlipidemia model and Lactobacillus treatment groups. The latter two groups were fed high fat diet. Three groups were administrated by gavage with 0.9% normal saline, skim milk and skim milk inoculated with Lactobacillus once daily for 21 consecutive days and fasted overnight after the last administration. On the following day, blood and livers were taken for the determination of serum lipid indicators. Besides, rat stools were collected during the last three days of administration and tested for TC, total bile acid (TBA) and short-chain fatty acid (SCFA) levels. Results: Lactobacillus fermentum MGH13-1 showed excellent BSH activity. Serum of TC, TG and LDL-C levels and liver TC level were signif i cantly lower, while fecal TC, TBA and SCFA levels were signif i cantly higher in MGH13-1 treatment group, when compared to high fat model group (P ＜0.05). Conclusion: Lactobacillus MGH13-1 has a remarkable hypolipidemic effect in hyperlipidemic rats.

Lactobacillus；L. fermentum MGH13-1；bile salt hydrolase；hyperlipidemic rat；hypolipidemic effect

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0257-06

2012-01-16

国家自然科学基金项目(30840011；31160315)；中国科学院西部之光人才培养计划项目；内蒙古农业大学博士启动基金项目(BJ08-18)；内蒙古自然科学基金项目(200508010406；2011MS1205；20102010)

王俊国(1970ü)，男，副教授，博士，主要从事乳品微生物研究。E-mail：junguo379@yahoo.com.cn

*通信作者：张和平(1965ü)，男，教授，博士，主要从事乳品科学研究。E-mail：hepingdd@vip.sina.com