羊肚菌发酵产物功能性研究

吕晓莲，郭 宏，贾建会，陶国琴，彭义交，郭鸿源，曹 炜，徐增慧，田 旭

(1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科学研究院，北京 100068)

羊肚菌发酵产物功能性研究

吕晓莲1，郭 宏1，贾建会1，陶国琴2，彭义交1，郭鸿源1，曹 炜1，徐增慧1，田 旭1

(1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科学研究院，北京 100068)

目的：羊肚菌是一种珍稀食(药)用真菌，具有极高的营养和药用价值。本实验对羊肚菌液体发酵产物对小鼠免疫功能和抗辐射功能的影响进行研究，为该产品开发应用提供依据。方法：按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的检验方法，对小鼠进行细胞免疫功能和单核-巨噬细胞功能实验以研究其增强免疫力功能；通过外周血白细胞计数实验、骨髓细胞DNA含量实验和小鼠骨髓细胞微核实验，研究其抗辐射功能。结果：羊肚菌发酵产物具有增强免疫功能的作用及对有对辐射危害有辅助保护功能的作用。结论：羊肚菌发酵产物具备开发成增强免疫及抗辐射方面保健品的潜力。

羊肚菌；发酵；增强免疫；抗辐射

羊肚菌(Morchella)隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discornycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)[1]，它是世界公认的一种珍贵、稀有的食(药)用真菌[2]。羊肚菌具有非常高的营养价值，张广伦等[3]对新疆产粗柄羊肚菌子实体的营养成分进行了测定，结果表明羊肚菌子实体中含有蛋白质22.06%，粗脂肪3.82%，碳水化合物40.00%。与子实体相比，发酵所得到的羊肚菌菌丝体同样具有很高的营养价值，并且菌丝体中必需氨基酸超过了子实体的含量[4-6]。

此外羊肚菌还具有较高的保健和药用价值，早在《本草纲目》中就记载了它具有助消化、补肾、补脑等功效。现代医学研究还表明，羊肚菌含有多种活性物质，Tomita[7]从羊肚菌中提纯分离得到血小板集落抑制因子；Iwahara[8]、Saegusa[9]等从羊肚菌中获得黑色素形成抑制剂；Cavazzoni[10]、Moriguchi等[11]研究还显示羊肚菌具有较强的纤维素酶和谷氨酰转肽酶活性；大量研究还表明，羊肚菌中最重要的生物活性物质为羊肚菌多糖，它具有调节免疫、抗疲劳、降血脂、抗肿瘤等作用，并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副反应[12]；Duncan等[13]从羊肚菌子实体中分离出了一种分子质量为106D的半乳甘露聚糖，具有提高巨噬细胞吞噬能力、提高人体免疫力的功效。

本项目组经多年研究，优化了羊肚菌液体发酵培养基和发酵工艺条件，确定发酵产物的主要功效成分为羊肚菌粗多糖[14]。另外，相关研究也表明通过液体发酵获得的羊肚菌多糖同样具有生物活性，如陈彦等[15]通过对羊肚菌发酵液胞外多糖药理活性的研究表明，羊肚菌胞外多糖(EPM)高、低两个剂量均能显著抑制S-180肿瘤的生长；Nitha等[16]研究表明羊肚菌菌丝体乙醇水溶液提取物具有抗氧化、抗炎症和抗肿瘤的作用；Mau等[17]研究发现羊肚菌菌丝体甲醇提取物具有抗氧化的作用；贠建民[18]研究表明羊肚菌发酵液在提高机体对运动负荷的适应能力、抵抗疲劳的产生和加速疲劳消除方面具有明显作用；张利平等[19]研究表明发酵羊肚菌多糖可以显著增强小鼠的非特异性免疫及细胞免疫；孙玉军等[20]研究表明发酵羊肚菌胞内多糖对小鼠肝脏的损伤有保护作用。但到目前为止，尚未发现羊肚菌子实体和羊肚菌液体发酵产物具有抗辐射作用的相关研究报道。

本实验按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的增强免疫力功能和对辐射危害有辅助保护功能检验方法，研究羊肚菌液体发酵产物对小鼠免疫功能和抗辐射作用的影响，为开发保健食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊肚菌菌种(Morchella esculenta(L.)Pers)，购自河南省微生物研究所；10oBx的羊肚菌发酵产物，中试实验制备；补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、印度墨汁、都氏试剂、Hank’s液 上海抚生实业有限公司；小牛血清上海酶联生物科技有限公司；绵羊红细胞(SRBC) 郑州百基生物技术有限公司；Gimesa染液 南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物

选用1月龄清洁级昆明种小鼠，雌性，体质量19～24g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SXXK-(军)2002-001。动物实验室合格证号：SYXK(京)2002-0022。

1.3 仪器与设备

BIOSTAT®E小型发酵罐 德国贝朗国际生物工程公司；LABOROTA 4000旋转蒸发器 德国Heidolph公司；DL-CJ-IND超级洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；754分光光度计、TDL-5-A高速离心机上海安亭科学仪器厂；游标卡尺(精密度0.02mm) 北京精益恒源量具有限公司；FA2004电子天平 上海天平仪器厂；MEK-6318K全自动血球计数仪 上海东湖仪器试剂科技有限责任公司；Plus384酶联免疫光谱分析仪美谷分子仪器(上海)有限公司；钴源 北京大学医学部钴源室。

1.4 方法

1.4.1 羊肚菌发酵产物制备

图 1 羊肚菌液体发酵工艺流程图Fig.1 Procedure for preparation of fermentation products from Morchella

原料处理及配料：将大麦芽粉碎后，按1:10(m/V)加水搅拌，37℃保持20min，再升温至65℃保持1.5h左右，糖化至加碘溶液不显蓝色为止，再升至95℃保持10min灭酶，以4层纱布过滤，糖化成6oBx麦芽汁后取4L加入液体培养基中；称90g大豆粉按1:20(m/V)加水搅拌，再加入0.04%中性蛋白酶，45℃保持2h后，再升至95℃保持10min灭酶，用4层纱布过滤，加入液体培养基中；称50g红茶粉碎后，按1:20加水搅拌，90℃保持45min，用4层纱布过滤，加入液体培养基中；再加入300g蜂蜜，加水至10L。

发酵罐及培养基灭菌条件：发酵罐115℃，20min；培养基121℃，30min。然后将灭菌后培养基降至28℃。

接种：把原菌种按无菌操作接种在斜面培养基上，置28℃培养箱培养72h，取斜面菌种约5mm2菌膜接种在液体发酵培养基中，置28℃旋转振荡培养，60r/min培养72h作为Ⅰ级摇瓶菌种，Ⅰ级菌种液按2%接种量接种在液体发酵培养基中，置28℃旋转振荡培养，60r/min培养72h为Ⅱ级摇瓶菌种，将Ⅱ级摇瓶菌种2%接种到小发酵罐中，28℃培养72h，溶解氧量80%，控制 pH值为6.6。

菌丝体处理：将菌丝体加3倍水经胶体磨磨碎，90℃浸提150min。

浓缩：将合并滤液浓缩用旋转蒸发器进行浓缩至10oBx，得到羊肚菌液体发酵产物，羊肚菌粗多糖含量≥220mg/100mL。

1.4.2 剂量选择与受试液给予方式

经前期预实验表明，羊肚菌粗多糖含量为2.75mg/kg (以体质量计)时即有一定的生物活性。因此，建议人体推荐摄入量为：75mL/(人gd)(以人体质量60kg计，即1.25mL/kg)。

按增强免疫功能和辐射危害有辅助保护功能检验方法要求，分别设计3个实验组和1个对照组，3个实验组给予受试液的量分别是人体推荐摄入量的30、10倍和1倍。具体如下：

将羊肚菌发酵产物浓缩至67oBx，取该浓缩液56mL加去离子水至100mL，混匀作为实验组3(即37.5mL/kg (以体质量计)，人体推荐摄入量的30倍)的受试液；再将实验组3的受试液分别稀释3倍和30倍，作为实验组2(即12.5mL/kg，人体推荐摄入量的10倍)和实验组1(1.25mL/kg，人体推荐摄入量)的受试液。各组均按0.1mL/10g经口灌胃，对照组小鼠给予去离子水。各组均喂以基础饲料饲养。

1.4.3 动物实验方法

小鼠检疫3d，未见异常，可用于实验。

将96只小鼠分成两批进行增强免疫功能实验，每批48只，一批用于细胞免疫功能ü ü迟发型变态反应(DTH)实验，一批用于单核-巨噬细胞功能üü小鼠碳廓清实验。将每批小鼠再随机分为4组，每组12只分笼饲养，按实验剂量每天灌胃1次，连续30d，于第30天给予受试液后对小鼠进行各项免疫指标测定。

将80只小鼠分成两批进行对辐射危害有辅助保护功能实验，每批40只，一批用于外周血白细胞计数(WBC)实验，另一批用于小鼠骨髓细胞微核实验和骨髓细胞DNA含量实验。将每批再随机分成4组，每组10只分笼饲养，按实验剂量每天灌胃1次。

1.4.3.1 DTH测定(足跖增厚法)

于第30天给予受试液后，给每组12只小鼠腹腔注射体积分数2%的绵羊红细胞(SRBC)，每只注射0.2mL(约1h108个SRBC)。4d后测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射体积分数20% SRBC进行攻击，每只注射0.02mL(约1h108个SRBC)，注射后24h分别测量左后足跖部厚度，计算攻击前、后的差值。

1.4.3.2 小鼠碳廓清实验

于第30天给予受试液后，给每组12只小鼠尾静脉注射0.2mL用生理盐水稀释5倍的印度墨汁。待墨汁注入2min和10min后分别从内眦静脉丛取血20µL，加到2mL 0.1% Na2CO3溶液中，在600nm波长处测光密度(OD600nm)，以Na2CO3溶液作空白对照。再将小鼠处死，取肝脏和脾脏称质量，计算吞噬指数(α)。

式中：OD1、OD2分别表示墨汁注入2min和10min测定的光密度值；t1、t2分别为2min和10min。

1.4.3.3 白细胞总数(WBC)实验

连续40d给予受试液，在给予受试液的第27天时给各组小鼠均用5Gy Co60-γ射线全身照射1次。分别于照射前、照射后第3天和照射后第14天取尾血20µL，加到0.38mL 0.1%盐酸中，混匀后加入血球计数板中，计算计数池中4个大方格中WBC，并分别比较辐射前、辐射后第3天和辐射后第14天对辐射组和各实验组WBC总数的变化。

1.4.3.4 小鼠骨髓细胞微核实验和骨髓细胞DNA含量实验

连续30d给予受试液，在给予受试液的第27天时给各组小鼠均用5Gy Co60-γ射线全身照射1次。于照射后第3天颈椎脱臼处死小鼠，常规取胸骨，用小牛血清冲洗胸骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇中固定5～10min，放入Gimesa应用液中，染色5～10min，立即用磷酸盐缓冲液冲洗，晾干，油镜下对每只小鼠观察1000个嗜多染红细胞，计算含微核细胞数及微核细胞率，微核率以千分率表示。剥离出股骨，取1mL Hank’s液，冲出股骨中的全部骨髓细胞，混匀后用酶联免疫光谱分析仪于波长260nm处测定骨髓细胞DNA含量。核酸的最大吸收波长为260nm，在波长260nm时，OD260nm值为1相当于DNA质量浓度50μg/mL。

1.4.3.5 数据统计

2 结果与分析

2.1 羊肚菌发酵产物对小鼠DTH的影响

绵羊红细胞(SRBC)刺激T淋巴细胞增殖成为致敏淋巴细胞，攻击部位出现肿胀的程度反映了迟发型变态反应程度。测量结果见表1。由表1可知，实验组2和实验组3的小鼠足跖厚度增加明显差异具有显著性或极显著性(P＜0.05或P＜0.01)，说明羊肚菌发酵产物具有细胞免疫功能。

表 1 羊肚菌发酵产物对小鼠DTH的影响(±s,n＝12)Table 1 Effect of Morchella fermentation products on DTH of rats (±s,n＝12)

表 1 羊肚菌发酵产物对小鼠DTH的影响(±s,n＝12)Table 1 Effect of Morchella fermentation products on DTH of rats (±s,n＝12)

注：*. 与阴性对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；**. 与阳性对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

组别足跖增加厚度/mmP值实验组10.24f0.090.272实验组20.28f0.06*0.027实验组30.29f0.09**0.008阴性对照组0.20f0.06

2.2 羊肚菌发酵产物对小鼠碳廓清能力的影响

表 2 羊肚菌发酵产物对小鼠碳廓清能力的影响(x±s,n＝12)Table 2 Effect of Morchella fermentation products on carbon clearance capacity of rats (x±s,n＝12)

由表2可知，实验组2和实验组3的小鼠碳廓清能力明显升高，与对照组相比差异具有显著性或极显著性(P＜0.05或P＜0.01)，说明羊肚菌发酵产物具有单核-巨噬细胞功能。

2.3 小鼠辐射模型成立检验

表 3 小鼠辐射模型对照组辐射前后白细胞总数自身比较(±s,n＝12)Table 3 Comparison of rat model control group before and after irradiations, n＝12)

表 3 小鼠辐射模型对照组辐射前后白细胞总数自身比较(±s,n＝12)Table 3 Comparison of rat model control group before and after irradiations, n＝12)

辐射模型对照组白细胞总数/(109/L)F值P值辐射前12.73f2.10辐射后第3天1.38f0.35280.30.000

由表3可知，与辐射前相比较，辐射后第3天辐射模型对照组的白细胞总数急剧下降，差异具有极显著性，F值为280.3，P值为0.000，说明辐射损伤对照组成立，可以进行相应的功能实验。

2.4 羊肚菌发酵产物对WBC计数的影响

表 4 羊肚菌发酵产物对WBC计数的影响(±s,n＝10)Table 4 Effect of Morchella fermentation products on WBC of rats (±s,n＝10)

表 4 羊肚菌发酵产物对WBC计数的影响(±s,n＝10)Table 4 Effect of Morchella fermentation products on WBC of rats (±s,n＝10)

注：*.与辐射模型对照组相双有显著性差异(P＜0.05)；**.与辐射模型对照组相比有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

组别辐射前辐射后第3天辐射后第14天实验组112.68f 1.871.62f 0.452.19f 0.41实验组212.59f 2.051.87f 0.35**2.49f 0.41*实验组312.75f 1.801.97f 0.34**2.54f 0.43**辐射模型对照组12.73f 2.111.38f 0.352.01f 0.40

由表4可知，辐射前各实验组与辐射模型对照组的WBC总数比较，差异无显著性，可以进行照射和后续实验。辐射后第3天和辐射后第14天各实验组的WBC总数均高于辐射模型对照组，其中实验组2和实验组3的WBC总数与辐射模型对照组相比，白细胞总数明显增多，差异具有显著性或极显著性(P＜0.05或P＜0.01)，说明羊肚菌发酵产物具有抗辐射损伤的功能，可降低血液系统受损程度。

2.5 羊肚菌发酵产物对小鼠骨髓细胞微核实验和骨髓细胞DNA含量的影响

表 5 羊肚菌发酵产物对小鼠骨髓细胞微核实验和骨髓细胞DNA含量的影响(±s,n＝10)Table 5 Effect of Morchella fermentation products on bone marrow cell micronucleus and DNA content of myeloma cells in mice(±s,n＝10)

表 5 羊肚菌发酵产物对小鼠骨髓细胞微核实验和骨髓细胞DNA含量的影响(±s,n＝10)Table 5 Effect of Morchella fermentation products on bone marrow cell micronucleus and DNA content of myeloma cells in mice(±s,n＝10)

组别观察嗜多染红细胞数含微核细胞数细胞微核率/骨髓细胞DNA含量(OD600nm值)实验组110h100011.4f2.411.42.39f0.87实验组210h100011.2f1.811.2*3.45f1.31实验组310h100010.8f2.410.8*4.10f2.12*辐射模型对照组10h100013.8f3.913.82.38f0.78

由表5可知，照射后第3天，各实验组小鼠骨髓细胞微核率明显低于辐射模型对照组，其中实验组2和实验组3的小鼠骨髓细胞微核率与辐射模型对照组相比，差异具有显著性(P＜0.05)。另外，再由骨髓细胞DNA含量测定结果可知，各实验组小鼠骨髓细胞DNA含量明显高于辐射模型对照组，其中实验组3的小鼠骨髓细胞DNA含量与辐射模型对照组相比，差异具有显著性(P＜0.05)。说明羊肚菌液体发酵产物具有抗辐射损伤的功能，可降低机体染色体和造血系统受损程度。

3 结 论

本实验按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的检验方法，对羊肚菌液体发酵产物进行增强免疫力功能和对辐射危害有辅助保护功能的实验研究。通过对小鼠细胞免疫功能和单核-巨噬细胞功能实验结果表明羊肚菌发酵产物具有增强免疫功能的作用；同时通过外周血白细胞计数实验、骨髓细胞DNA含量实验和小鼠骨髓细胞微核实验结果表明羊肚菌发酵产物还具有对辐射危害有辅助保护功能的作用。该研究结果为将羊肚菌液体发酵产物开发成保健食品产品提供了科学依据。

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Functional Evaluation of Fermentation Products from Morchella

LÜ Xiao-lian1，GUO Hong1，JIA Jian-hui1，TAO Guo-qin2，PENG Yi-jiao1，GUO Hong-yuan1，CAO Wei1，XU Zeng-hui1，TIAN Xu1
(1. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China；2. Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China)

The immunoregulatory and anti-radiation effect of fermentation products (fermentation supernatant plus hot water extract of Morchella mycelia) from Morchella in mice was evaluated according to the Technical Standards for Testing & Assessment of Health Food (2003 version, Ministry of Health, People’s Republic of China) by mouse monocyte-macrophage function test, peripheral leukocyte count, DNA content of myeloma cells test and mouse bone marrow cell micronucleus test. Our results showed that these fermentation products can exert an immunoenhancing effect in mice and helped protect against radiation hazards and hence have great potential to be developed as immunoenhancing and anti-radiation products.

Morchella；fermentation；immunoenhancing effect；anti-radiation

TQ920.1；TS218

A

1002-6630(2013)01-0311-04

2012-11-23

吕晓莲(1970ü)，女，高级工程师，硕士，研究方向为食品工程与营养。E-mail：xiaolian1992@sina.com