高效液相色谱-串联质谱法测定肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基

王薇，刘明东，颜有仪，叶懿，赵俊红，熊卉，肖敏，廖林川

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都 610041；2.四川大学华西药学院，四川成都 610041）

高效液相色谱-串联质谱法测定肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基

王薇1，刘明东2，颜有仪1，叶懿1，赵俊红2，熊卉1，肖敏1，廖林川1

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都 610041；2.四川大学华西药学院，四川成都 610041）

目的 建立灵敏、准确的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法。方法肝组织匀浆液中加入内标地塞米松，用二氯甲烷提取后挥干，残渣加入甲醇溶液溶解并上样到ProElut C18固相萃取柱上分离净化，应用HPLC-MS/MS正离子多反应监测模式测定。结果肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在1～204 ng/g和1～206 ng/g范围内线性关系良好。检测限（S/N≥3）均为0.3ng/g。基质效应为96.5%～126.7%。萃取回收率为70.0%～82.3%。日内及日间精密度均小于10%。结论所建方法灵敏、可靠，能满足法医毒物分析的鉴定需要。

法医毒理学；串联质谱法；高效液相色谱法；华蟾酥毒基；酯蟾毒配基

华蟾酥毒基和酯蟾毒配基为蟾酥（由蟾蜍动物头、舌、肝、胆、耳后腺及皮肤腺的白色分泌物加工而成的固状物）毒基类的主要毒性成分，基本结构为具有六元不饱和内酯环的甾体化合物，是一类乙型强心苷元的衍生物。蟾酥具有消肿、镇痛、强心、抗感染、抗肿瘤等功效，可内服和外用，被广泛用于传统复方中药制剂中。然而，蟾酥具有较强心脏毒性和细胞毒性，治疗量和致死量相近，安全系数低，且中毒症状出现时间短。因此，偶有服用含蟾酥中药或捕食蟾蜍造成中毒或死亡的案例报道[1-2]。

文献[3-7]报道各类复方中药制剂中蟾酥毒基类成分测定方法较多，有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）等。生物检材中蟾酥毒基类成分的测定也有报道，研究对象多选用血液[8-13]，然而蟾酥毒基类成分在血液中代谢速度快、消除半衰期短，在实际法医学鉴定工作中，血液并不是最合适的检材。与血液相比，选择全身最大代谢器官的肝作为检材更合理。目前仅有HPLC法检测肝组织中蟾酥毒基类成分的报道[14-15]，由于蟾酥中毒剂量小，组织中检测难度高，需要灵敏度更高的检测方法。因此，本研究选择液-固萃取结合固相萃取的样品前处理方法，采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLCMS/MS）对肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基进行定性定量分析，并将此方法用于蟾酥中毒案件的鉴定工作。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Agilent G6410A三重串联四极杆质谱仪配Agilent 1200液相色谱仪（美国Agilent Technologies公司），VisiprepTM固相萃取仪（美国Supelco公司），ProElut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL，北京迪马科技有限公司）。

华蟾酥毒基对照品（中国药品生物制品检定所，批号110803-200605，含量按纯品计），酯蟾毒配基对照品（中国食品药品检定研究院，批号110718-201102，含量98.9%），地塞米松对照品（中国药品生物制品检定所，批号100129-200804，含量99.6%），二氯甲烷（色谱纯）、甲醇（色谱纯），去离子水经优普纯水系统制备。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18液相色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流动相及梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。

表1 梯度洗脱条件

1.3 质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI）源，正离子模式；干燥气温度：350℃；干燥气流速：9.0 L/min；雾化气压力：275.8 kPa；毛细管出口电压：4 000 V，采用多反应监测模式（MRM）。检测离子为华蟾酥毒基m/z 443.2→187.0（定量离子）、365.0，酯蟾毒配基m/z 385.2→105.0（定量离子）、349.0，内标地塞米松m/z 393.1→373.2（定量离子）、355.2。

1.4 标准溶液配制

精密称取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松对照品各适量，用甲醇分别配制成1.02、1.03和1.05mg/mL的储备液，4℃冰箱保存。临用前用甲醇稀释至所需浓度。

1.5 样品预处理

称取空白匀浆肝组织1 g，向内加入100 μL 0.84μg/mL地塞米松甲醇溶液（内标），混匀，用12mL二氯甲烷分3次提取，每次涡旋混合5 min，2 432×g离心5min，取下层提取液，合并提取液，置于40℃氮气流下吹干。残渣用100 μL甲醇溶解，并加入5 mL去离子水混匀，将上清液上样到ProElut C18固相萃取柱，依次用3mL去离子水和2mL 10%甲醇溶液洗去杂质，用3mL二氯甲烷洗脱待测组分，洗脱液置于40℃氮气流下吹干，残渣用0.5mL甲醇溶解，9576×g离心10min后，取上清液10μL进样分析。

1.6 工作曲线、检测限和定量限考察

取空白匀浆肝组织若干份各1 g，加入系列质量浓度华蟾酥毒基对照品溶液（0.010 2、0.020 4、0.051、0.102、0.204、0.510、1.02、2.04μg/mL）和酯蟾毒配基对照品溶液（0.0103、0.0206、0.0515、0.103、0.206、0.515、1.03、2.06μg/mL）各100μL，按照1.5项方法处理，在选定条件下进行分析，分别以华蟾酥毒基和酯蟾毒配基与内标峰面积的比值（y）对质量分数（x）进行线性回归，以S/N≥10时的质量分数为定量限，以S/N≥3时的质量分数为检测限。

1.7 精密度考察

取空白匀浆肝组织若干份各1 g，添加华蟾酥毒基对照品溶液（0.051、0.204、1.02 μg/mL）和酯蟾毒配基对照品溶液（0.0515、0.206、1.03 μg/mL）各100 μL，制得低、中、高质量分数的质控样品，每一质量分数5份，按照1.5项方法处理，在选定条件下进行分析。在同一天内每一质量分数重复测定5份质控样品，同法连续测定3d，得日内精密度和日间精密度。

1.8 萃取回收率和基质效应考察

取空白匀浆肝组织若干份各1 g，添加低、中、高质量分数的华蟾酥毒基对照品溶液和酯蟾毒配基对照品溶液，按照1.7项质量浓度制备，每一质量分数5份，按照1.5项方法处理，以质控样品中待测物峰面积与空白检材经提取净化后添加得相应质量浓度的待测物峰面积比得到萃取回收率。

取空白匀浆肝组织若干份各1g，按照1.5项方法提取净化后，将洗脱液置于40℃氮气流下挥干，添加低、中、高质量浓度的华蟾酥毒基对照品溶液和酯蟾毒配基对照品溶液，按照1.7项质量浓度制备，置于40℃氮气流下挥干，残渣用0.5mL甲醇定容，9576×g离心10min后进样分析。以空白肝提取净化后添加样品峰面积与相应质量浓度对照品溶液峰面积比得到基质效应。

1.9 稳定性考察

取空白匀浆肝组织若干份各1 g，添加低、中、高质量分数的华蟾酥毒基对照品溶液和酯蟾毒配基对照品溶液，按照1.7项质量浓度制备，再按照1.5项方法处理后，分别将样品置于室温20～25℃中放置0、4、8h及-20℃放置0、1、3d后取样测定，考察实验条件下样品的稳定性。

2 结果

2.1 色谱及质谱图

在上述选定的色谱条件下，肝组织添加样品中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松分离良好，保留时间分别为7.709、8.130和4.541 min，HPLC-MS/MS总离子流图见图1，华蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松的二级质谱图见图2。

图1 华蟾酥毒基（A）、酯蟾毒配基（B）和地塞米松（C）的HPLC-MS/MS总离子流图

图2 华蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松的二级质谱图

2.2 线性方程、检测限和定量限

肝组织中华蟾酥毒基在1～204 ng/g范围内线性关系良好（r=0.9995），线性方程为y=4.7377x+0.0122，检测限为0.3ng/g，定量限为1.02ng/g；酯蟾毒配基在1～206 ng/g范围内线性关系良好（r=0.999 8），线性方程为y=6.7222x+0.0188，检测限为0.3ng/g，定量限为1.03ng/g。

2.3 精密度

肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基低、中、高质量分数的质控样品的精密度见表2。结果显示，华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的日内精密度均小于3%，日间精密度均小于10%，方法精密度良好。

2.4 萃取回收率和基质效应

肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基低、中、高质量分数的质控样品的萃取回收率和基质效应见表3，结果表明，肝组织中低、中、高质量分数华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的基质效应为96.5%～126.7%，萃取回收率为70.0%～82.3%。

表2 肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的精密度

表3 肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的基质效应和萃取回收率

2.5稳定性

稳定性考察结果显示，于室温20～25℃中放置4、8h的低、中、高质量分数的质控样品与放置0h相比，肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量测定相对偏差均小于5%，而于-20℃放置1、3d与0d相比，相对偏差均小于10%，能够达到生物检材的分析要求，确保测定结果的准确性。

2.6 案例应用

某年3月13日，一名59岁妇女服用含蟾酥成分的中药丸后出现不适，约3.5h后死亡。半年后取死者肝组织用本研究所建方法检验，检出华蟾酥毒基和酯蟾毒配基成分，其中华蟾酥毒基质量分数为1.81ng/g。

在死者肝组织中也检出酯蟾毒配基，但未达到定量限。可能是由于蟾酥致死量较低，而检材送检时间与死者死亡时间相距已有半年，酯蟾毒配基发生降解，以及肝组织腐败等原因造成的。

3 讨论

3.1 样品预处理条件的选择

本研究曾考察采用肝组织匀浆高速离心后，取上清液直接进行固相萃取的前处理方法，结果发现在色谱分析中，待测组分保留时间点共流出组分较多，即使调整流动相比例也不能优化分离，严重影响了离子化效率，且匀浆后取上清液上样，萃取回收率仅为30%～40%。因此考虑在固相萃取之前增加液-固萃取的步骤，最终的分析结果显示优化后的萃取回收率提高到了70.0%以上。

在液-固萃取溶剂的选择方面，考察了乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷3种溶剂。结果表明，乙醚和乙酸乙酯会提出较多油脂成分，提取液难以挥干，二氯甲烷极性较大，能相对减少对油脂类成分的提取，减少杂质干扰，提取液挥干时间也较短。

结合文献[16]报道蟾酥毒基类在甲醇和二氯甲烷中溶解度最好，考察了甲醇和二氯甲烷为洗脱溶剂的情况，结果表明，甲醇洗脱液中杂质较多，回收率为60%左右，而二氯甲烷比甲醇能减少对杂质的洗脱，降低共流出组分的干扰，回收率更高。预试验分段收集了前、中、后段各3mL洗脱液，结果显示，前段洗脱液中两种待测组分回收率分别为80%和73%，中、后段洗脱液中均未检出两种待测组分。

结合以上研究结果，选择二氯甲烷为液-固萃取溶剂和洗脱溶剂，洗脱体积为3mL。

3.2 色谱条件优化

本研究比较了甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液两种流动相系统，结果显示，相对于乙腈-0.1%甲酸溶液，虽然甲醇-0.1%甲酸溶液系统响应高约20%，但柱压较高，最高可达45 MPa，待测组分的峰形较差，影响了两种待测组分的分离度，因此综合考虑，选择乙腈-0.1%甲酸溶液流动相系统。由于待测组分极性较小，需要用大比例有机相洗脱，等度洗脱情况下峰分离度较差，因此选用梯度洗脱的方法分离待测组分。本研究同时考察了30、40和50℃下待测组分的色谱行为，最终结果显示无明显差别。

3.3 内标的选择

结合蟾酥毒基类的化学结构和理化性质，考察了两种甾体化合物地塞米松和泼尼松龙作为内标的情况，结果显示两者回收率均为75%～80%，与待测物近似且稳定，而地塞米松在选定的试验条件下保留时间与待测物更接近，因此选择地塞米松作为内标。

综上，本研究所建立的运用HPLC-MS/MS法检测肝组织中两种蟾酥毒基成分的方法，灵敏、可靠，与参考文献[12-13]相比，在定量限及检测限方面都有了较大进步，适用于法医毒物分析鉴定工作。

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Determination of Cinobufagin and Resibufogenin in Liver Tissue by HPLC-MS/MS

WANG Wei1,LIU Ming-dong2,YAN You-yi1,YE Yi1,ZHAO Jun-hong2,XIONG Hui1,XIAO Min1,LIAO Lin-chuan1
（1.West China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,China; 2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China）

ObjectiveTo develop a sensitive and accurate assay for detecting cinobufagin and resibufogenin in liver tissue using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）. Methods The homogenization of liver tissue with internal standard dexamethasone was extracted with dichloromethane.The extracts with methanol were purified through ProElut C18solid phase extraction and tested in positive electrospray ionization with multiple reaction monitoring of HPLC-MS/MS.ResultsThe good linear relationship of cinobufagin and resibufogenin in liver tissue were 1-204ng/g and 1-206ng/g, respectively.The minimal detection threshold（S/N≥3）of this method was 0.3ng/g for both cinobufagin and resibufogenin.The matrix effect was 96.5%-126.7%.The extraction recovery coefficient was 70.0%-82.3%. The precision of intra-day and inter-day was less than 10%.ConclusionThis method is sensitive and reliable,and can be used in forensic toxicological analysis.

forensic toxicology;tandem mass spectrometry;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;cinobufagin;resibufogenin

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.008

1004-5619（2013）04-0268-05

2012-10-16）

（本文编辑：刘伟）

王薇（1986—），女，四川泸州人，硕士研究生，主要从事法医毒物分析研究；E-mail：freja_v@163.com

廖林川，男，博士，教授，主要从事法医毒物分析教学及科研工作；E-mail：linchuanliao@scu.edu.cn