pEGFP－IFI16表达载体构建及其表达对Hep－2细胞增殖的影响

虞 游，张艳欧，赵文铖，白 坚，陈建明

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036）

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的5．7%～7．6%，近年来发病率有逐渐上升趋势，但其发病机制还不清楚，已有资料表明喉癌发生除了与p53等肿瘤抑制基因有关外，高风险人乳头瘤病毒感染也能诱导喉癌发生．目前喉癌治疗手段主要为手术、放疗与化疗3种方法，但预后往往不理想并且有很大毒副作用，因此，寻找喉癌发病相关基因，对于揭示喉癌发病分子机理以及喉癌早期诊断与预防都有重要作用［1－3］．

最近，我们用干扰素－γ（IFN－γ）处理培养的人喉癌细胞系Hep－2细胞，发现干扰素－γ能抑制Hep－2细胞的增殖并诱导干扰素可调控表达的IFI16基因表达，但不影响与IFI16基因同源的MNDA基因表达，我们推测干扰素－γ抑制Hep－2细胞增殖可能是通过诱导IFI16基因表达而介导［4］；Azzimonti等也报道IFI16基因表达高低与喉癌的增殖性及其预后好坏相关，增殖性低预后好的喉癌标本中IFI16基因表达高，而增殖性高预后差的喉癌标本中IFI16基因表达则低下［5］；由此推测，IFI16基因在喉癌细胞增殖中起抑制作用，本文以喉癌细胞系Hep－2细胞作为研究材料，通过构建IFI16基因的增强绿色荧光蛋白融合表达载体，利用基因外来过表达探讨IFI16基因在喉癌细胞增殖中的作用．

1 材料和方法

1．1 主要仪器

MyGene PCR仪（杭州朗基公司），Tanon Gis System凝胶成像系统（上海天能科技），Incustar 210型CO2培养箱（BioSource），CKX41倒置相差显微镜（Olympus），BX－51荧光显微镜（Omachi），ProgRes数码照相系统（Jenoptik），Guava easyCyte 8HT流式细胞仪（Millipore）．

1．2 主要试剂

Trizol试剂（BioBasic），BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒（RNase H－）（碧云天），Taq DNA聚合酶（上海鼎国），DNA片段纯化／回收试剂盒（碧云天），DNA分子量标准、BamH I、PstI及T4DNA连接酶（碧云天），牛小肠碱性磷酸酶（Takara），X－gal及IPTG（碧云天），Plasmid Maxi Kit（QIAGEN），Lipofecter转染试剂（碧云天），重组人干扰素－γ（PeproTech），RPMI－1640培养基（北京赛默飞世尔），新生小牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶及双抗（碧云天）．

1．3 质粒、菌种和细胞系

大肠杆菌DH5α为本室保存，质粒pUCm－T购自碧云天公司，pEGFP－C1载体由浙江大学医学院提供．人喉癌细胞系Hep－2细胞购自中科院上海细胞库，贴壁培养于含10%新生小牛血清及1%青、链霉素的RPMI－1640培养基中，于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，每隔2～3d换一次液．

1．4 IFI16基因cDNA合成

培养的人喉癌细胞系Hep－2细胞用10ng／mL干扰素－γ处理48h后，消化收集细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，取2μg总RNA用BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒将其逆转录合成cDNA，取2μL cDNA作为模版用PCR技术扩增IFI16基因编码区cDNA．PCR扩增引物序列为，上游引物：5－GGCGGATCCATGGGAAAAA－3，下游引物：5－GGCGGATCCCAGATTTTAGAAGAAA－3；PCR扩增条件为：94℃预变性5min后94℃变性35s，54℃退火35s，72℃延伸2min 35s，35个循环后72℃延伸10 min．PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，割胶纯化回收目的基因片段，将回收的目的基因连接到pUCm－T载体并进行测序，经测序正确后进行下一步实验．

1．5 pEGFP－IFI16真核表达载体的构建

经测序正确的目的基因片段用BamH I酶从pUCm－T载体上切出，凝胶电泳纯化回收目的IFI16基因片段．同时，用BamH I酶切增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pEGFP－C1，纯化回收后再用碱性磷酸酶CIAP处理BamH I酶切的pEGFP－C1载体．随后，将纯化回收的pEGFP－C1载体与纯化回收的IFI16基因片段进行连接，连接产物转化感受态菌DH5α后涂板培养过夜，第二天挑取若干白色菌落分别培养24h后制备质粒DNA，最后，用PstI酶切筛选IFI16基因正向插入的pEGFP－IFI16融合蛋白表达载体．

1．6 pEGFP－IFI16载体转染Hep－2细胞

将指数生长的Hep－2细胞接种于24孔细胞培养板，每孔接种1×104细胞于0．5mL RPMI－1640培养基中，培养24h后，用Lipofecter试剂将Plasmid Maxi Kit制备的pEGFP－IFI16载体DNA或pEGFPC1空载体DNA各1μg分别转染导入Hep－2细胞，每次实验时每种载体DNA分别转染3个复孔的细胞．

1．7 pEGFP－IFI16载体在Hep－2细胞中表达检测

pEGFP－IFI16载体或pEGFP－C1空载体转染Hep－2细胞48h后，分别消化收集细胞，然后分别用荧光显微镜及半定量RT－PCR技术分析pEGFP－IFI16载体在Hep－2细胞中的表达情况．荧光显微镜分析时，细胞先用1×PBS漂洗2次，然后用488nm激发波长在荧光显微镜下观察细胞发出的绿色荧光信号，并用ProgRes数码系统拍摄照片．半定量RT－PCR分析时，先用Trizol试剂分别提取细胞总RNA，各取2μg总RNA用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，再各取2μL cDNA作为模板用PCR分析IFI16基因及内对照β－actin基因表达情况．PCR扩增IFI16基因时，引物序列为上游引物5’－CCAAGACTGAAGACTGAA－3’，下游引物5’－TAGAAGAAAAAGTCTGGTGAAGTTTCCATACTTG－3’，扩增条件为94℃预变性4min后94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环后72℃延伸10min；PCR扩增β－actin基因时，引物序列为上游引物5’－GCGGGAAATCGTGCGTGACATT－3’，下游引物5’－GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG－3’，扩增条件为94℃预变性4min后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，22个循环后72℃延伸10min．

1．8 pEGFP－IFI16载体表达对Hep－2细胞增殖影响分析

Hep－2细胞按上述方法接种于24孔培养板后，分别用pEGFP－IFI16载体或pEGFP－C1空载体进行转染或不进行转染，从第二天开始，每种转染每天收集3个复孔细胞，用流式细胞仪计数每孔细胞的细胞数值，然后分别求出每种转染每天3个复孔细胞计数值的平均值及标准差，最后以天数为横坐标（转染后24h、48h及72h分别命名为day 1、day 2及day 3）、以天数对应的平均值为纵坐标，绘出每种转染细胞的生长曲线．实验独立重复3次（n＝3），以分析pEGFP－IFI16载体表达对Hep－2细胞增殖的影响．

2 结 果

2．1 pEGFP－IFI16真核表达载体的构建

RT－PCR扩增得到一条符合预期大小（2 190bp）的DNA条带（图1），将其纯化回收后克隆到pUCm－T载体上，经测序证实该DNA条带正是我们所需的IFI16基因．随后，用BamH I酶将IFI16基因从pUCm－T载体上切出，纯化回收后，将其克隆到pEGFP－C1载体多克隆位点的BamH I切点上，用PstI酶切筛选IFI16基因的正反向插入，正向插入时PstI酶切得到6 419bp和495bp两条带，而反向插入时PstI酶切则得到5 305bp和1 609bp两条带，最后筛选得到IFI16基因正向插入的pEGFP－IFI16融合蛋白表达载体（图2）．

图1 RT－PCR扩增IFI16基因Fig．1 IFI16gene amplification by RT－PCR

图2 PstI酶切筛选pEGFP－IFI16重组质粒Fig．2 Screening of pEGFP－IFI16recombinant plasmid by PstI digestion

2．2 pEGFP－IFI16载体在Hep－2细胞中的表达

pEGFP－IFI16载体转染导入Hep－2细胞48h后，在荧光显微镜下观察到Hep－2发出清晰的绿色荧光信号（图3A），同时，空载体pEGFP－C1转染的Hep－2细胞也观察到了清晰的绿色荧光信号（图3B），并且，空载体转染细胞的荧光信号比pEGFP－IFI16载体转染细胞的荧光信号要多得多，符合我们的预期，这是由于空载体比pEGFP－IFI16载体小因而其转染效率高之故，荧光显微镜分析结果说明，pEGFP－IFI16载体在Hep－2细胞中表达了EGFP－IFI16融合蛋白．pEGFP－IFI16载体转染导入Hep－2细胞48h后，半定量RT－PCR分析发现，Hep－2细胞IFI16基因mRNA水平要明显高于空载体转染细胞及不转染细胞中IFI16基因的mRNA水平（图4），半定量RT－PCR分析结果进一步说明，pEGFP－IFI16载体在Hep－2细胞中表达了EGFP－IFI16融合蛋白．

图3 pEGFP－IFI16重组质粒在Hep－2细胞中表达EGFP－IFI16融合蛋白Fig．3 pEGFP－IFI16recombinant plasmid expressedEGFP－IFI16fusion protein in Hep－2cells

2．3 pEGFP－IFI16载体表达抑制Hep－2细胞的增殖

流式细胞仪计数测定细胞生长曲线显示，pEGFP－IFI16载体转染后第一天时，Hep－2细胞其增殖速度与空载体pEGFP－C1转染细胞及不转染细胞的增殖速度没有差异，但从第二天起，pEGFP－IFI16载体转染的Hep－2细胞其增殖速度要慢于空载体转染细胞及不转染细胞的增殖速度，至第三天时，pEGFP－IFI16载体转染的Hep－2细胞其增殖速度明显慢于空载体转染细胞及不转染细胞的增殖速度（见图5），统计分析差异有显著性（P＜0．05），由此说明，pEGFP－IFI16载体表达能抑制Hep－2细胞的增殖．流式细胞仪计数测定细胞生长曲线结果说明，IFI16基因对Hep－2细胞增殖起抑制作用．

图4 半定量RT－PCR分析pEGFP－IFI16重组质粒转染后Hep－2细胞IFI16基因mRNA水平Fig．4 mRNA level of IFI16gene analyzed by semi－quantitative RT－PCR in Hep－2cells transfected with pEGFP－IFI16recombinant plasmid

图5 pEGFP－IFI16重组质粒表达抑制Hep－2细胞的增殖Fig．5 Expression of pEGFP－IFI16recombinant plasmid inhibited the proliferation of Hep－2cells

3 讨 论

喉癌发病率近年来有逐渐上升趋势，由于传统喉癌治疗手段预后不理想且有很大毒副作用，因此，揭示喉癌发病的分子机制，为临床开展早期喉癌分子诊断及基因干预与预防提供理论基础显得尤为重要．

近年来有报道发现喉癌的增殖性及预后好坏与IFI16基因表达高低有关［5］；我们的初步研究结果也发现，IFI16基因可能介导干扰素－γ对喉癌细胞增殖的抑制作用［4］．IFI16基因是人体内的干扰素－γ可诱导表达基因，它属于干扰素可诱导的IFI－200（又称HIN－200）蛋白家族成员，除IFI16基因外，人体内还有其它3个成员，分别为MNDA（myeloid nuclear differentiation antigen）基因、AIM2（absent in melanoma 2）基因和IFIX（IFI－inducible protein X）基因．IFI16基因位于人一号染色体1q21－23区域，研究发现人一号染色体1q21－23区域的遗传改变与某些肿瘤及自身免疫疾病有关，目前已知IFI16基因是系统性红斑狼疮的易感基因，此外，近年来越来越多的研究报道IFI16基因在肿瘤中也起作用［6－10］．

本研究通过构建IFI16基因的荧光蛋白融合表达载体，在喉癌细胞系Hep－2细胞中表达IFI16基因的融合蛋白，研究IFI16基因在喉癌细胞增殖中的作用．首先，利用RT－PCR及基因克隆等技术，成功将IFI16基因编码区cDNA克隆到增强绿色荧光蛋白表达载体pEGFP－C1中，并利用荧光显微镜及半定量RT－PCR技术分析构建载体在Hep－2细胞中的表达情况，最后成功构建了能在Hep－2细胞中表达IFI16基因的荧光融合蛋白的pEGFP－IFI16载体；随后，将pEGFP－IFI16载体转染导入Hep－2细胞，用流式细胞仪计数测定细胞生长曲线，结果发现pEGFP－IFI16载体转染的Hep－2细胞，从第二天起其增殖速度慢于空载体转染细胞及不转染细胞的增殖速度，至第三天时pEGFP－IFI16载体转染Hep－2细胞其增殖速度明显慢于空载体转染细胞及不转染细胞的增殖速度，由此说明pEGFP－IFI16载体表达能抑制Hep－2细胞的增殖．本研究结果证明IFI16基因对Hep－2细胞增殖有抑制作用，本研究也为我们的后续研究打下了一定的研究基础．

［1］Gil Z，Fliss D M．Contemporary management of head and neck cancers［J］．Isr Med Assoc J，2009，11（5）：296－300．

［2］Chow C W，Tabrizi S N，Tiedemann K，etal．Squamous cell carcinomas in children and young adults：a new wave of a very rare tumor［J］．J Pediatr Surg，2007，42（12）：2035－2039．

［3］Nadal A，Cardesa A．Molecular biology of laryngeal squamous cell carcinoma［J］．Virchows Arch，2003，442（1）：1－7．

［4］陈建明，赵菁，葛莉伟．干扰素－γ对喉癌Hep－2细胞增殖和凋亡的影响［J］．中国细胞生物学学报，2011，33（3）：258－262．

［5］Azzimonti B，Pagano M，Mondini M，etal．Altered patterns of the interferon－inducible gene IFI16expression in head and neck squamous cell carcinoma：immunohistochemical study including correlation with retinoblastoma protein，human papillomavirus infection and proliferation index［J］．Histopathology，2004，45（6）：560－572．

［6］赵菁，陈建明，邱明，等．干扰素诱导的IFI－200蛋白家族研究进展［J］．杭州师范大学学报：自然科学版，2009，8（5）：375－380．

［7］Choubey D，Deka R，Ho S．Interferon－inducible IFI16protein in human cancers and autoimmune diseases［J］．Frontiers in Bioscience，2008，13：598－608．

［8］Ludlow L E，Johnstone R W，Clarke C J．The HIN－200family：more than interferon－inducible genes［J］．Experimental Cell Research，2005，308（1）：1－17．

［9］Mazibrada J，De Andrea M，RittàM，etal．In vivo growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma by the Interferon－inducible gene IFI16［J］．Cancer Lett，2010，287（1）：33－43．

［10］Alimirah F，Chen J M，Davis F J，etal．IFI16in human prostate cancer［J］．Mol Cancer Res，2007，5（3）：251－259．