尼氟灭酸和钙通道阻断剂对γ-氨基丁酸激活电流去敏感的作用*

李 丽，汪 洋，马克涛，成洪聚，赵 磊，司军强△

（1.石河子大学医学院生理和病理生理教研室，2.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室-电生理研究室，新疆石河子832002）

γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）作为一种重要的中枢抑制性神经递质，广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统，对神经系统具有普遍的抑制性作用。GABA在抗焦虑、抗惊厥、镇痛和调节内分泌等方面发挥着重要作用［1］。GABA激活的受体分为三类，包括 GABAA、GABAB和 GAGAC，其中GABAA和GABAC属超家族配体门控离子通道受体，GABAB属G蛋白偶联受体。目前认为GABAA受体包括氯通道和五个分别供GABA、苯二氮类（benzodiazepine）、巴比妥类（barbiturates）、苦味毒（picrotoxin）及麻醉药作用的结合位点［2］，上述药物可通过与其相应部位的结合调节GABAA受体对GABA的反应。GABAA受体已有至少19个受体亚单位被成功克隆，已鉴定的GABAA受体主要由α、β、γ和δ构成，其中除δ亚基外，每一种亚基均有不同的异构体存在（α1-α6、β1-β4和γ1-γ4），α6和γ2又各有两个剪接变异体。目前认为GABAA受体是由不同亚基构成的五聚体，被GABA激活后通过开启Cl-通道产生抑制作用，其效应可被荷包牡丹碱（bicuculline）阻断。GABAA受体本身作为通道-受体复合体还有多种药物的结合位点，这些药物结合位点与GABA识别位点在构像上相互作用，直接或间接参与Cl-通道的门控过程，发挥着加强或抑制GABA的药理学作用。

非甾体类抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是目前临床使用较为广泛的一类药物，其通过抑制环氧合酶和前列腺素的合成发挥解热、镇痛和抗炎作用［3］。已有文献报道，NSAIDs对中枢神经系统神经元GABAA受体功能也存在着重要的调节作用［4］，我们前期的研究也发现NSAIDs对背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）神经元 GABAA受体的激活电流有明显的抑制作用，这一作用我们推测可能是通过抑制钙激活的氯离子通道（calciumactivated chloride channels，CaCC）实现的，事实是否如此还需进一步深入研究。本研究选择非甾体类的抗炎药物尼氟灭酸（niflumic acid），观察尼氟灭酸和钙离子通道阻断剂对DRG神经元GABA激活电流的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

实验所用动物由新疆医科大学医学实验动物养殖中心提供的4周龄SD大鼠（200～250 g），雌雄不限，动物质量符合一级标准。葡萄糖酸钾、胶原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂、荷包牡丹碱（bicuculline）、GABA、尼氟灭酸、HEPES为 Sigma公司产品，其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 主要仪器

Axon 700B放大器（美国Axon公司）、P-2000拉制仪（美国 Sutter公司）、生物电信号记录计算机（Axoscope 10.2软件，美国 Axon公司）。

1.3 细胞制备

实验动物为4周龄的SD大鼠，击昏、断头后迅速切开背部皮肤沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨，取出胸腰段脊柱由脊柱正中剖开成两半置于O2饱和的细胞外液中，外液成分为（mmol／L）：NaCl 150；KCl5；CaCl22.5；MgCl21；HEPES 10；D-glucose 10，pH＝7.4溶液渗透压为340mOsm。由剖开的椎管内侧取出神经节及相连的神经前后根和脊神经，在显微镜下用角膜剪及游丝镊剪除相连的神经和结缔组织，将分离出的DRG剪碎转移至培养皿内，加胰蛋白酶 0.25mg／ml，胶原酶 0.5 mg／ml后移于试管中，在37℃恒温温箱中孵育15min。然后加入适量胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶的消化。将上述机械分离和酶处理的 DRG神经元离心（1 000 r／min，6 min），然后转移至培养皿内，室温（20～30℃）下静置至少30min［5］。

1.4 全细胞膜片钳记录

使用Axon 700B放大器（美国Axon公司）进行实验记录，玻璃微电极用P-2000拉制仪（美国Sutter公司）拉制，电极阻抗约为1～5 MΩ，玻璃微电极所充内液成分为（mmol／L）：KCl 140；CaCl21；MgCl22；HEPES 10；EGTA 11，细胞外液的成分为（mmol／L）：NaCl150；KCl 5；CaCl22.5；MgCl21；HEPES 10；d-glucose 10，在电极与细胞膜形成高阻（1～5GΩ）封接后将膜吸破然，然后调节电容和串联电阻补偿保持电压为负 60mV。膜电流应用低通滤波（10 Hz）［5］。药物均采用无糖外液配制，pH为7.4。给药系通过微操纵器移动快速换液装置的排药管进行，排药管的每个管口的直径0.5 mm，管口距所记录的细胞100 μm，实验在室温22～30℃范围进行。GABA激活电流的去敏感拟合采用Clampfit 10.2软件（美国Axon公司）进行。

1.5 统计学分析

实验数据采用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，给药前后采用两均数的t检验来分析数据。

2 结果

本实验所检测的大鼠新鲜分离DRG细胞呈圆形或椭圆形。实验选用的细胞轮廓清晰，折光性强，直径在20μm～45μm之间，静息电位为（-59±7.1）mV（n＝223）。其中部分细胞连有被离断的轴索突起残端，呈卷曲状。

2.1 GABA激活DRG神经元的内向电流

被测 DRG的神经元中有 95.11%（212／223）对外加 GABA（0.1～1 000μmol／L）敏感，GABA引起明显的内向电流，且具有明显的去敏感现象（图1），即虽然GABA持续存在且浓度不变，但GABA激活电流达到顶峰后，电流幅值立即呈指数衰减直到达到一稳定值。GABA激活内向电流的 EC50为（28.2±2.5）μmol／L（n＝9）。100μmol／L的 GABA引起的电流幅值为（1.32±0.74）nA（n＝84）。该电流可被GABAA受体特异性拮抗剂荷包牡丹碱（bicuculline，100μmol／L）几乎完全阻断 （n＝8，图 1），这一结果与我们实验室前期的研究结果一致［5］。

Fig.1 Effect of bicuculline（100μmol／L）on the GABAA receptor GABAA：Gamma aminobutyric acid A receptor

2.2 尼氟灭酸浓度依赖性的抑制GABA激活电流

预灌流不同浓度的尼氟灭酸后，给予相应浓度GABA，发现预加尼氟灭酸可抑制GABA激活电流的幅值，尼氟灭酸对GABA激活电流的抑制作用具有浓度依赖性，IC50为（27.24±4.63）μmol／L（n＝56）。1μmol／L、10μmol／L和100μmol／L的尼氟灭酸对GABA激活电流幅值的抑制率分别为（6.13%±3.21%）（n＝8）、（31.60% ±4.87%）（n＝19）和（59.80%±6.23%）（n＝15，图 2）。但尼氟灭酸没有改变 GABA激活内向电流的 EC50值（（28.2±2.5）μmol／L，n＝9），与不预灌流尼氟灭酸相比，GABA激活内向电流的 EC50差异无显著性（P＞0.05）［5］。

Fig.2 Records of GABA（100μmol／L）-activated currents with pretreatment of niflumic acid

2.3 尼群地平浓度依赖性的抑制GABA激活电流

DRG神经元全细胞膜片钳记录形成后，胞外给予 GABA（100μmol／L）约5 s，记录GABA激活电流，外液冲洗2min后再一次记录GABA激活电流作为前对照。预加不同浓度特异性L-型钙通道阻断剂尼群地平20 s后，给予相应浓度尼群地平与GABA（100μmol／L）混合药物，记录 GABA激活电流。预加 0.1μmol／L、1μmol／L、10μmol／L和 30μmol／L的尼群地平均致GABA激活电流幅值降低，其抑制率分别为（18.90% ±2.14%）（n＝12）、（42.50% ±5.95%）（n＝10）、（43.60%±5.10%）（n＝5）和（49.60%±8.70%）（n＝6），与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05，图 3）。

Fig.3 Records of GABA（100μmol／L）-activated currents with pretreatment of nitrendipine

2.4 尼氟灭酸对DRG神经元GABA激活电流去敏感的作用

图4所示，100μmol／L的尼氟灭酸对 GABA激活内向电流产生明显的抑制作用，经指数方程f（t）＝∑Aie-t／τi＋C拟合后（见图 4中的下图），发现 GABA激活内向电流的去敏感呈双指数特性，τ值分别为（14.68±5.11）s（n＝6）和（175.80±42.67）s（n＝6）（r＝0.9647），表明 GABA激活电流的去敏感包括快、慢两个时相［5］。预加尼氟灭酸之后，GABA激活电流幅值受抑制的同时，GABA激活电流的去敏感仍为双指数特性，τ值分别减少为（4.64±2.21）s（n＝3）和（43.70±14.34）s（n＝3）（r＝0.9548），提示尼氟灭酸抑制GABA激活内向电流可能是通过加速去敏感来实现的。

Fig.4 Tracings and fit curves of the desensitization of GABA（100 μmol／L）-activated currentswith presentand non-presentniflumic acid（100μmol／L）

2.5 氯化镍对DRG神经元GABA激活电流去敏感的作用

图5所示，100μmol／L的氯化镍（非特异性钙离子通道阻断剂，包括阻断L-型电压依赖性钙通道）对GABA激活内向电流也有明显的抑制作用，经指数方程 f（t）＝∑Aie-t／τi＋C拟合后（见图 5中的下图），GABA激活内向电流的去敏感的双指数特性保持不变，τ值分别为（14.68±5.11）s（n＝6）和（175.80±42.67）s（n＝6）（r＝0.9647）。但预加氯化镍之后，GABA激活电流幅值受抑制的同时，GABA激活电流的去敏感仍为双指数特性，τ值分别减少为（3.76±2.21）s（n＝3）和（133.45±47.54）s（n＝3）（r＝0.9721），提示氯化镍抑制 GABA激活内向电流主要抑制了快去敏感时相，对慢去敏感时相的作用不明显。

Fig.5 Tracings and fit curves of the desensitization ofGABA（100 μmol／L）-activated currents with present and non-present niekel chloride（100μmol／L）

3 讨论

GABA是脊髓主要的抑制性神经递质，在初级感觉信息传递（尤其是伤害性感受）通路的控制中发挥重要作用。DRG神经元膜有GABAA及GABAB受体共存已经得到证实。脊髓GABA能中间抑制性神经元释放GABA作用于初级传入终末（DRG假单极神经元中枢突末梢）的GABAA受体，增加DRG神经元Cl-电导，导致Cl-外流，产生初级传入末梢去极化［6］，导致传入神经冲动的幅度降低，产生突触前抑制，减少末梢神经递质的释放，使背角痛敏神经元的活动减弱，对初级感觉传入尤其是痛觉的上传起到抑制作用［7］。因此，研究DRG神经元GABAA受体的作用和被调节机制，对阐明初级感觉信息传入的突触前机制具有重要意义。

已有大量的文献报道，NSAIDs对中枢神经系统神经元GABAA受体功能也存在着重要的调节作用［4，8］。GABAA受体作为配体门控离子通道能被很多药物调控，包括苯（并）二氮卓类、巴比妥类、类固醇、惊厥剂和麻醉剂［9］。已有报道，尼氟灭酸对GABAA和 NMDA受体有调节作用［4，8］。甲芬那酸（一种非甾体抗炎药物）能直接作用于神经元膜的GABAA受体［10］。尼氟灭酸也可以作为正性变构调节剂作用于α1β2γ2组成的 GABAA受体，另外，尼氟灭酸也能作为负性变构调节剂作用于α6β2和α6β2γ2组成的GABAA受体［9］。我们的研究表明，尼氟灭酸没有改变GABA激活内相电流的EC50（约为30μmol／L）值，但明显使 GABA激活电流最大值减少约60%，表明尼氟灭酸对GABA激活电流的抑制作用是非竞争性的。实验还发现GABA激活内向电流的去敏感呈双指数特性，GABA激活电流的去敏感包括快、慢两个时相，τ值分别为（11.60±4.23）s（n＝3）和（175.80±42.67）s（n＝3，r＝0.9616）。预加尼氟灭酸之后，GABA激活电流幅值受抑制的同时，GABA激活电流的去敏感仍为双指数特性，τ值分别减少为 4.64 s和 43.70 s（r＝0.9548），提示尼氟灭酸抑制GABA激活内向电流可能是通过加速去敏感（包括快、慢两个时相）来实现的。

已有资料表明钙激活氯通道在神经元兴奋、平滑肌生理特性的维持等许多生理过程中起重要作用。成年大鼠DRG神经元有基础钙激活氯通道表达［11］，研究发现神经损伤可致大、中型DRG神经元上钙激活氯通道表达的上调。尼氟灭酸是一种环氧化酶抑制剂，也是目前公认的一种较强的钙激活氯通道（calcium-activated chloride channels，CaCC）阻断剂［12］。本实验发现尼氟灭酸对GABA激活的内向电流有明显的浓度依赖性抑制，表明钙激活氯通道可能与GABA介导的Cl-外流有关。而钙激活氯通道是钙和电压依赖性的，钙激活氯通道取决于细胞内钙离子浓度的升高［12］。为揭示GABA激活电流与Ca2＋的关系，本实验预灌流L-型钙通道阻断剂尼群地平和氯化镍阻断Ca2＋内流后，GABA激活电流幅值明显降低。实验结果表明Ca2＋在GABA激活氯通道开放中起重要作用，细胞外Ca2＋内流可能通过激活氯通道调节GABA激活电流。

由实验可以推测：当初级感觉信息传入脊髓背角，脊髓抑制性中间神经元释放GABA，作用于DRG神经元中枢端末梢GABAA受体介导Cl-外流，引起去极化电流产生，膜去极化激活电压依赖性钙通道，导致Ca2＋内流，细胞内Ca2＋浓度升高激活DRG神经元膜上钙激活氯通道，促进Cl-进一步外流产生内向电流，加速DRG神经元的去极化，形成一个正反馈。结果使DRG神经元传至初级传入终末的动作电位幅度变小，时程缩短，由此使递质的释放量减少，最终导致脊髓中枢神经元的兴奋性突触后电位减小，实现突触传递的前抑制作用。

［1］ Bormann J.The‘ABC’ofGABA receptors［J］.TrendsPhar-macol Sci，2000，21（1）：16-19.

［2］ Wu J，Harata N，Akaike N.Potentiation by sevoflurane of theγ-aminobutyric acid-induced chloride current in acutely dissociated CA1 pyramidal neurones from rat hippocampus［J］.Br JPharmacol，1996，119（5）：1013-1021.

［3］ Vane JR，Botting RM.Mechanism of action of nonsteroidal anti-inflammatory drugs［J］.Am JMed，1998，104（3A）：2S-8S.

［4］ Babot Z，Cristofol R，Sunol C.Excitotoxic death induced by released glutamate in depolarized primary cultures of mouse cerebellar granule cells is dependenton GABAA receptorsand niflumic acid-sensitive chloride channels［J］.Eur J Neurosci，2005，21（1）：103-112.

［5］ Si JQ，Zhang ZQ，LiCX，etal.Modulatory effectof substance P on GABA-activated currents from rat dorsal rootganglion［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25（5）：623-629.

［6］ Alvarez F J，Kavookjian A M，Light A R.Synaptic interactions between GABA-immunoreactive profiles and the terminals of functionally defined myelinated nociceptors in the monkey and cat spinal cord［J］.Neurosci，1992，12（8）：2901-2917.

［7］ 李 丽，赵言昌，王 磊，等.GABA引起正常和病理性疼痛大鼠DRG神经元去极化反应的比较［J］.石河子大学学报（自然科学版），2010，28（1）：63-67.

［8］ Sinkkonen ST，Mansikkamaki S，Moykkynen T，etal.Receptor subtype-dependent positive and negativemodulation of GABA（A）receptor function by niflumic acid，a nonsteroidal anti-inflammatory drug［J］.Mol pharmacol，2003，64（3）：753-763.

［9］ Mehta A K，Ticku M K.An update on GABAA receptors［J］.Brain Res Brain Res Rev，1999，29（2-3）：196-217.

［10］ Coyne L，Su J，Patten D，et al.Characterization of the interaction between fenamates and hippocampal neuron GABA（A）receptors［J］.Neurochem Int，2007，51（6-7）：440-446.

［11］ Sorota S.Pharmacologic properties of the swelling-induced chloride current of dog atrial myocytes［J］.J Cardiovasc Electrophysiol，1994，5（12）：1006-1016.

［12］ Hartzell C，Putzier I，Arreola J.Calcium-activated chloride channels［J］.Annu Rev Physiol，2005，67：719-758.