EPO基因3’端增强子T3541G单核酸多态性与有氧运动能力关联性研究*

刘海平，孔兆伟，胡 扬

（1.温州医学院体育科学学院，浙江 温州325035；2.澳门大学教育学院，澳门999078；3.北京体育大学，北京100084）

长期耐力训练可使机体心肺功能改善，血液携氧、运氧 能力提高，最终导致机体有氧运动能力提高。机体对耐力训练适应性的变化存在着明显的个体差异，产生这种差异很大程度上被认为与遗传因素有关［1，2］。

人类促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）基因定位于7q22，由4个内含子和5个外显子组成，其编码EPO蛋白在体内主要功能促进红细胞生成，提高血液的携氧、运氧能力，对改善机体的运动能力及适应缺氧环境是非常有利的。

本文选取位于人类EPO基因3’端的SNP／T3541G多态位点，研究该位点与有氧耐力训练后生理表型指标变化的关联性，探讨其作为筛选预测有氧耐力训练效果的分子遗传学标记的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选取102名北方汉族新兵，平均年龄：18.82±0.88岁、平均身高：（171.67±5.82）cm、平均体重：（60.27±6.54）kg，所有士兵入伍前均无系统的训练史。

1.2 实验方法

1.2.1 有氧耐力训练方案 所有受试者每周3次，每次进行5 000 m匀速跑，持续18周，实验第1～10周采用95%个体通气阈强度训练；第10～18周运动强度增至105%。所有受试者日常作习、饮食、活动均保持一致。

1.2.2 生理指标测试 所有生理指标在18周有氧耐力训练前后各测试 1次。最大摄氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）、通气无氧阈（ventilation aerobic threshold，VT）采用递增负荷实验由气体代谢仪分析测试（JAEGER Oxygen Analyzer，德国产）；血红蛋白（hemoglobin，Hb）采用血细胞计数仪（COULTER Ac，美国产）测定；身体成分（体重、瘦体重、体脂百分比）采用体成分仪（Tanita-DX200，日本产）测定。

1.2.3 EPO基因 SNP／T3541G解析 依据 NCBI提供的 EPO基因3’端增强子序列，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。上引物：5’ACT CTT GGCTTTTCTGTTTTCTGGG 3’；下引物：5’TACTGCGGT GAGGCCTTGAAT GTA G 3’。20μl反应体系（mmol／L）：包括 Tris-HCl（pH 8.3）10，KCl 50，MgCl21.5，0.001%明胶，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 200μmol／L，上下引物各 0.5μmol／L，Taq酶 1U，模板 100 ng。PCR扩增在Gene Amp 2700进行，扩增产物为226 bp片段，限制性内切酶AccI在 37°C，5 h消化此段扩增产物，EB（ethidium bromide）染色，凝胶成像系统紫外光成像（上海复日）。

1.3 数据统计处理

有氧耐力训练前后生理指标数据以均值±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，训练前基因型组间生理指标差异用单因素分析（One-Way Anova）处理；基因型组间有氧耐力训练后生理指标变化量采用协方差处理。

2 结果

EPO基因SNP／T3541G基因型在士兵中的分布频率经卡方检验符合Hardy-Weinberg平衡。士兵人群具有群体代表性。

2.1 SNP／T3541G与体成分及Hb关联性

有氧耐力训练前后，SNP／T3541G各基因型受试者的体成分及Hb指标变化见表1。耐力训练前，经单因素方差分析显示，不同基因型受试者之间体重与瘦体重存在显著性差异（P＜0.01，P＜0.05），TT与 TG基因型受试者显著高于 GG型（P＜0.01）；有氧耐力训练后，经协方差分析显示，各基因型受试者之间体成分指标的变化量无显著性差异。

各基因型受试者的Hb在有氧训练前、后及前后变化量均无统计学意义。

Tab.1 Changes of body composition between genotype in SNP／T3541G of EPOgene（¯x±s）

2.2 SNP／T3541G与有氧运动能力关联性

耐力训练前，各基因型受试者之间VO2max存在不同的趋势（P＜0.10），TG型受试者最高为（3461.18±326.15）ml／min，依次为TT型、GG型，TG、TT与GG型相比有显著性差异（P＜0.05）。不同基因型受试者之间的rVO2max没有显著性差异；训练后，不同基因型受试者之间的VO2max、rVO2max变化量均无显著性差异（表2）。

SNP／T3541G各基因型受试者耐力训练前、后VT结果见表2。耐力训练前，各基因型受试者之间VT／VO2、VT／VE有不同趋势（P＜0.10），GG基因型受试者的 VT／VO2、VT／VE显著低于 TT型（P＜0.05），GG基因型的 VT／VO2明显低于 TG基因型 （P＜0.05），各基因型受试者之间 VT／HR和 VT／rVO2等指标无统计学意义；耐力训练后，各基因型受试者之间VT／VE、VT／VO2、VT／rVO2和 VT／HR的变化量均无明显差异。

3 讨论

本研究发现，耐力训练前，SNP／T3541G与体重和瘦体重有明显关联性。TT与TG基因型受试者的体重、瘦体重明显高于GG基因型受试者（P＜0.01），耐力训练后体成分指标的变化量与该多态性无关联。

仅从EPO自身的生物学功能上看，它对身体成分并无调节作用，但从人类基因图谱上分析，EPO基因与肥胖基因（obese gene，ob）均位于同一染色体—第7号染色体的7q22和7q31。ob基因的表达产物－瘦素在体内的主要生物学作用是调节脂肪的沉积、抑制食欲、减少能量摄入、增加能量消耗和抑制脂肪合成等，因此，SNP／T3541G多态性与耐力训练前体成分的关联可能是该位点与ob基因上某个影响该基因表达的多态位点连锁不平衡有关。但这一推论有待于进一步证实。

Tab.2 Changes of aerobic ability between genotype in SNP／T3541G of EPOgene（¯x±s）

本研究发现，耐力训练前，在 VO2max、VT／VO2和 VT／VE等指标上，TG与TT基因型受试者表现出一定的优势，均明显高于GG基因型，18周耐力训练后，基因型组间在VO2max、VT等指标无显著性差异。此外，本研究未发现该位点与耐力训练前、后血红蛋白浓度存在关联。

SNP／T3541G位于EPO基因3’端增强子上。EPO基因增强子位于聚腺嘌呤核苷酸位点下游116 bp，该增强子上的顺式调节元件对EPO基因的转录表达起着非常重要作用。有研究报道，增强子与反式作用因子特异结合后能使EPO基因表达提高3～13倍［3］。3’端低氧诱导增强子在功能上划分3个区域，第一区域是HIF-1和另外两种结构性表达的转录因子ATF-1，CREB-1的结合位点；第二区域在增强子中间部分，对低氧诱导EPO基因表达十分重要，第三区域的核苷酸序列高度保守，与该部位结合的反式作用因子可能是孤儿受体家族成员，研究发现肝核因子（HNF-4）与该部分结合，能明显上调EPO基因表达。许多转录因子结合在位于基因序列3 512 bp～3 740 bp间增强子三个功能部位后，提高EPO基因的转录表达，如将EPO基因增强子序列部分转染至Hep3B等细胞后，可以在低氧或CoCl2刺激下，大量EPO基因转录表达。

因此，在增强子区域产生的序列变异均有可能影响EPO基因转录、表达。SNP／T3541G与有氧耐力素质关联性直接报道较少。但关于SNP／T3541G与人血浆EPO水平关联性研究发现，无论汉、藏民族，携带TG杂合子基因型的受试者，其血浆EPO水平均高于其它基因型［4］。由此，表明此多态性位点与EPO生成可能相关联。这与本研究血红蛋白的变化不一致。提示，训练方案所安排内容对SNP／T3541G各基因型刺激可能不够，未引起机体产生明显耐力训练效果，也可能血红蛋白的生成不但与EPO有关，还与其它基因，如EPOR等的调控有关。

此外，本研究中观察到EPO基因SNP／T3541G与耐力训练前VO2max及VT指标显示出一定关联性，反映出TG、TT基因型受者在先天耐力素质上可能具有一定优势，但这一结果与耐力训练前各基因型血红蛋白值并不一致，而与身体成分数据具有一致性，即 TG、TT基因型 VO2max、VT／VO2高，LBW也高，由此表明影响VO2max的因素不只是血液运氧能力，可能还与身体成分因素相关。SGoya研究报道，身体LBW对肺功能有积极影响，身体脂肪量对肺功能产生消极影响，即LBW超高，机体肺功能水平超强［5］，这可能会导致有氧工作能力指标，如 VO2max、VT／VO2改善。

［1］ He Z，Hu Y，Feng L，et al.Association between HMOX-1 genotype and cardiac function during exercise［J］.Appl Physiol Nutr Metab，2008，33（3）：450-460.

［2］ Di MM，Izzicupo P，Santarelli F，et al.ACE and AGTR1 polymorphisms and left ventricular hypertrophy in endurance athletes［J］.Med Sci Sports Exerc，2010，42（5）：915-921.

［3］ Cramer T，Yamanishi Y，Clausen BE，et al.HIF-1alpha is essential for myeloid cell-mediated inflammation［J］.Cell，2003，112（5）：645-657.

［4］ 刘 舒，裴澍萱，张世馥，等.西藏高原红细胞增多症患者红细胞生成素低氧反应增强子多态性研究［J］.中华血液学杂志，2000，21（9）：486-487.

［5］ Wannamethee SG，Shaper AG，Whincup PH.Body fat distribution，body composition，and respiratory function in elderly men［J］.Am J Clin Nutr，2005，82（5）：996-1003.