二次回归正交旋转组合优化罗非鱼下脚料酶解液螯合锌的工艺条件

李同刚，洪鹏志，杨 萍，赵 阳

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

罗非鱼是当前淡水养殖业的重要养殖品种之一。我国是世界上最大的罗非鱼养殖国及出口国，2009年产量已达120万t，约占当年世界总产量的一半。罗非鱼冻鱼片加工过程中会产生总质量40%以上的下脚料[1-3]。罗非鱼下脚料蛋白酶解液含有丰富的氨基酸、小肽、微量元素等多种小分子营养成分，具有生物利用率高等优点。锌是人体必需微量元素，参与体内200多种酶的组成，是细胞内最丰富的微量元素。根据报道，锌是中国人缺乏的营养素之一，尤其是儿童、青少年缺锌比较严重，严重的已经影响智力和身高的正常发育。目前关于酶解物螯合金属元素的研究很多，如赵洪雷等[4]制备了低质鱼小肽螯合锌；杨珊珊等[5]研究了罗非鱼皮多肽制备锌螯合盐；钟明杰[6]用带鱼下脚料蛋白水解原料得到了钙、铁螯合物；汪学荣[7]使用猪血多肽制备铁螯合盐等。本实验利用复合酶酶解罗非鱼下脚料，对酶解液与锌的螯合工艺进行优化，探讨螯合的最佳工艺条件，旨在为罗非鱼下脚料的综合加工利用提供新途径，并希望为人体补锌提供安全、绿色原料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼下脚料 由广东恒兴水产公司提供，罗非鱼下脚料（包括头、鱼骨排、内脏）去内脏，洗净，于绞肉机中绞碎后-18℃冻藏备用；中性蛋白酶（2.0×105U/g）、风味蛋白酶（1.5×104U/g）均购于南宁庞博生物工程有限公司；EDTA、硫酸锌 均为分析纯，购于广州化学试剂厂；二甲基橙 分析纯，广东光华化学厂有限公司。

PHS-3C酸度计 上海精密科学仪器有限公司；Mini pellicon超滤机 美国Thermo公司；DK-98-1电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机 日本日立公司；EMS-4B磁力搅拌器 天津市欧诺仪器仪表有限公司；N-1100旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解液的制备 取罗非鱼下脚料一定量置于烧杯中，按固液比1∶4加水，于55℃的恒温水浴锅中预热，按总加酶量1500U/g、中性蛋白酶与风味蛋白酶复合比1∶2加酶，pH不调，酶解30min。然后沸水灭酶15min，4500r/min离心15min得到上清液。将上清液通过0.45μm膜微滤，再过10ku超滤膜得到小于10ku的酶解液。

1.2.2 α-氨基态氮的测定 甲醛滴定法[8]。

1.2.3 螯合工艺

1.2.3.1 配位比对螯合率的影响 酶解液与硫酸锌在配位比（α-氨基态氮与锌离子的摩尔比[9]）设为1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1。

1.2.3.2 温度对螯合率的影响 螯合温度设为40、50、60、70、80℃。

1.2.3.3 时间对螯合率的影响 时间设为10、15、20、25、30min。

1.2.3.4 pH对螯合率的影响 螯合pH设为5、6、7、8、9。

在单因素实验基础上，进行二次回归正交旋转组合设计。螯合工艺流程：酶解液→测α-氨基态氮→按比例加Zn2+→搅拌→振荡合成→离心分离→真空浓缩→乙醇洗涤→测螯合率。

1.2.4 螯合率的测定 EDTA络合滴定法[10]。

式中：C-EDTA标准溶液的浓度，mol/L；V1-滴定螯合态微量元素所消耗的EDTA溶液体积，mL；V0-滴定微量元素的总量所消耗的EDTA溶液体积，mL。

1.2.5 二次回归正交旋转组合设计 依据单因素实验的结果，确定因素编码水平范围，采用二次回归正交旋转组合设计，以螯合率为指标，取配位比、温度、时间、pH作为考察因素，共进行31次实验，因素编码见表1。

1.2.6 实验结果处理 本实验均做了三次平行，结果为三次实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 酶解液与硫酸锌螯合的单因素实验

2.1.1 配位比对螯合率的影响 配位比是影响螯合率的一个重要因素，因为配位比过小不能形成稳定的环状结构[5]，导致螯合率较低；反之过大，螯合物虽稳定但是螯合率也在下降，造成原料的浪费，经济上也不合理。由图1可知，在温度60℃，时间15min，pH6.5时，配位比对螯合率的影响呈波动变化，配位比在2.5∶1时螯合率达到最大值。

2.1.2 温度对螯合率的影响 由图2可知，在配位比2.5∶1，时间15min，pH6.5条件下，随着温度的升高螯合率也升高，当温度在60～70℃时螯合率最高，再升高温度螯合率下降。这是由于螯合反应为吸热反应[11]，温度高有利于螯合反应，但温度过高酶解液里的肽及其螯合物的结构易被破坏；温度过低，反应速率慢，螯合率不高。

2.1.3 时间对螯合率的影响 由图3可知，在配位比2.5∶1，温度60℃，pH6.5条件下，时间在15min时螯合效果最佳，10min时螯合反应不完全，所以螯合率不高；15min之后随着超滤酶解液中肽或氨基酸浓度的降低，螯合率也在下降。

2.1.4 pH对螯合率的影响 由图4可知，在配位比2.5∶1，温度60℃，时间15min条件下，pH对螯合率影响很大，随着pH升高螯合率先升后降，pH=7时效果最佳，当pH在5、6时螯合率缓慢上升，当pH＞7以后螯合率下降很快。原因可能是当溶液中H+大量存在时，H+会与锌离子争夺供电子基团，不利于螯合物的生成；另外，在碱性条件下，羟基争夺锌离子而优先生成氢氧化锌沉淀而影响螯合物的形成[12]。

2.2 二次回归正交旋转组合优化酶解液与硫酸锌的最佳螯合条件

2.2.1 经验数学模型 在单因素实验的基础上，根据表1因素水平编码表进行二次回归正交旋转组合实验，实验设计及结果见表2。

将实验结果经Design Expert软件处理，得到回归方程：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+0.30437X1X3+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.717282。

2.2.2 二次回归模型的显著性检验 二次正交旋转组合设计实验结果方差分析如表3所示。

为检验回归方程的有效性，按F1=失拟均方/误差均方，F2=回归均方/剩余均方的程序进行检验。由表3可知，在0.01水平上失拟项F1不显著、F2极显著，这表明方程与实验数据的配合是可行的，可以用来建立模型。

根据表3，剔除α=0.10显著水平不显著项后，简化后的回归方程为：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.71728。

该模型的R2=0.95588，R2adj=0.91727，说明回归方程对实际实验拟合情况较好。

2.2.3 模型验证 为验证模型的适用性，选取4组结果进行验证。结果见表4。

由表4可知，4组的螯合率测定结果与根据模型计算得到的结果误差均小于5%，说明该模型能较好地反映螯合过程螯合率的变化情况。

2.2.4 各因素的重要性分析 在表3里，因为X1、X2、X3、X4的均方分别为28.71094、12.48484、5.38654、18.42754，所以影响螯合率的四因素主次顺序为：配位比＞pH＞温度＞时间。

2.2.5 最佳螯合条件的确定 采用Design Expert软件分析实验数据，得到螯合的最佳条件为：配位比0.39水平（2.70∶1），温度0.25水平（71.25℃），时间0.22水平（15.44min），pH为-0.29水平（6.86），理想螯合率可达88.08%。考虑到实验室允许的条件以及实际应用过程中的必要性和可操作性，对优化的工艺参数进行了合理选择，即配位比2.70∶1、温度71.3℃、时间15min、pH6.86，验证实验结果表明，此时螯合率可达87.56%，与理论值相差1%之内。在相关研究中，低质鱼蛋白多肽在理想条件下与铁的螯合率为94.15%[5]；带鱼下脚料蛋白水解液在最佳条件下与钙螯合，螯合率达79.75%[6]，大部分植物蛋白螯合率不高。相比之下，本实验得到的螯合条件较合理。

3 结论

本实验在单因素实验结果的基础上，运用二次回归正交旋转组合设计的方法，确定了罗非鱼下脚料酶解液螯合锌的最佳螯合工艺条件为：配位比2.70∶1、温度71.3℃、时间15min、pH6.86，螯合率达到87.56%，其中，各个因素对螯合率影响大小的顺序是：配位比＞pH＞温度＞时间。

[1]杨萍.罗非鱼下脚料蛋白酶解液制备蔬菜泥罐头的研究[J].食品科技，2008（5）：89-91.

[2]赵梅.罗非鱼下脚料酶解工艺的响应面法优化[J].食品研究与开发，2007（5）：48-52.

[3]吴燕燕，李来好.酶法由罗非鱼加工废弃物制取调味料的研究[J].南方水产，2006，2（1）：49-53.

[4]赵洪雷，李春美.低质鱼小肽螯合锌制备工艺的研究[J].食品科技，2009（1）：18-19.

[5]杨珊珊.罗非鱼皮多肽锌螯合盐的制备及性质研究[D].南昌：南昌大学，2008.

[6]钟明杰.带鱼下脚料蛋白水解螯合物制备及生物特性研究[D].青岛：中国海洋大学，2009.

[7]汪学荣.猪血多肽铁螯合盐的制备技术及性质研究[D].重庆：西南大学，2008.

[8]陈义勇，王伟，沈宗根.罗非鱼下脚料水解工艺的研究[J].现代食品科技，2006，22（4）：136-138，126.

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