生物传感器在大肠杆菌O157∶H7检测中的应用

李蓉卓，刘 霞，李 蕾，李文进

(湖南农业大学食品科技学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128)

生物传感器在大肠杆菌O157∶H7检测中的应用

李蓉卓，刘 霞*，李 蕾，李文进

(湖南农业大学食品科技学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128)

生物传感器因其简单、快速、特异性强、灵敏度高等优越性越来越引起重视，已被广泛应用于各个研究领域。肠出血性大肠杆菌O157:H7自发现以来就被认为是危害性很大的致病菌，并且在世界范围内曾多次暴发食源性疾病，已成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题。因此，在食品安全领域，对大肠杆菌O157:H7检测方法的研究已成为热点。文章简单介绍了生物传感器的原理和分类，重点综述了近年来生物传感器在E.coli O157∶H7检测中的应用，并展望了其发展前景。

大肠杆菌O157∶H7；生物传感器；检测

0 引言

大肠杆菌O157∶H7(Escherichia coli O157:H7, E.coli O157:H7)是肠出血性大肠埃希氏杆菌的一个主要菌型[1]，自发现以来，已在世界范围内多次引发食源性疾病，污染的牛肉、牛奶、鸡肉、蔬菜、果饮料等均可成为传播媒介。人感染E.coli O157：H7，轻者会出现短暂腹泻、恶心、呕吐等症状，重者导致剧烈腹痛、出血性结肠炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合症[2]。因此，对于E.coli O157：H7进行快速、灵敏、实时检测具有重要的应用价值。

传统的微生物培养法[3~4]、生物发光法、细胞计数法等其检测时间长（2~3 d）、灵敏度低等缺点已不能完全满足现代E.coli O157：H7的检测要求。生物传感器因其特异性强、检测速度快、灵敏度高、试样用量少，操作简便的优势，在微生物检测领域已广泛应用，特别是对E.coli O157∶H7的鉴定与检测做了大量的研究工作。

该文简单介绍了生物传感器以及生物传感器的类型，重点综述了近年来生物传感器在E.coli O157∶H7检测中的应用。最后对生物传感器应用于检测E.coli O157∶H7的发展前景作出展望。

1 生物传感器

生物传感器[5]是生物学、电子信息学、化学、材料学等学科相互渗透、结合所发展起来的一种新型分析检测技术。它是以固定的生物成分(蛋白质、酶、DNA、抗体等)或生物体本身(细胞、微生物、组织等)作为敏感材料、与适当的化学物理换能器（如氧电极、光敏管、压电晶体等等）及信号放大装置相结合构成的一种快速检测各种生物、化学物质的分析检测仪器。它通过各种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感材料之间的反应，然后，将反应的程度转变可测量的光信号或电信号，根据所测量信号的大小推算出被测物的多少[6]。根据生物传感器所使用的检测元件不同，可将其分为光学生物传感器、压电生物传感器、电化学生物传感器等。与其他检测技术相比，生物传感器具有简单、快速、特异性强、灵敏度高等优点，具有良好的发展前景和应用潜力。

2 光学生物传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

2.1 表面等离子体共振 (sur face plasmon resonance,SPR)传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

SPR是一种物理光学现象，该技术是利用光在高折射率玻璃表面的金或其它金属材料薄膜发生全内反射时的消失波，引发金属表面的自由电子产生表面等离子体子（surface plasmons，SP）。在入射角或波长在某一适当值的条件下，SP与消失波的频率、波数相等，二者将发生共振。并在共振的条件下入射光被吸收，使反射光能量急剧下降，在反射光谱上出现共振峰 （反射强度最低值），当金属膜表面的介质折射率不同时，共振峰位置也将不同。SPR对金属表面的介质折射率微小变化是极其敏感的，待测物与金属薄膜接触时若存在吸附、生化反应或构象的改变，则金属表面的折射率就会发生变化，共振角随即发生改变[7]，据此，可对待测物进行检测和分析。SPR传感器具有显著特点[8]：1)实时检测；2)无需标记样品；3)灵敏度高；4）检测时间短。

殷涌光等[9]利用抗体免疫吸附反应，采用一次抗体-抗原-二次抗体的夹心免疫法，将胶体金抗体复合物作为第二抗体，并延长其与微生物的结合过程，稳定和放大信号，从而显著提高了检测灵敏度。王凯等[10]通过采用亲和素-生物素系统放大检测的响应信号,并引入复合抗体作为第二抗体，将SPR传感器对E.coli O157∶H7的检测限提高到了105CFU/mL，并且建立了细菌浓度与折射率对应的标准曲线，整个检测过程在1 h内完成。王一娴等[11]利用SPR建立消减抑制反应（subtractive inhibition assay） 方法检测 E.coli O157∶H7，检测灵敏度为3.0×104CFU/mL。后又引入生物凝集素作为受体[12]检测E.coli O157∶H7，检测限为3.0×103CFU/mL。Nancy等[13]应用T4噬菌体作为识别元，基于SPR检测E.coli O157∶H7，不到20 min就能完成检测并且最低检测限为103CFU/mL。Eum等[14]基于金纳米粒子(gold nanorods，GNRs)的增强响应信号作用，应用三明治夹心法，将GNR标记的抗体作为二抗，原抗体为一抗检测E.coli O157∶H7，结果表明在标记GNRs的前提下响应信号比没有标记的高 3.8倍。SPR目前没有大范围应用到实际检测的重要原因是：SPR的检测成本比较高，一次性使用的传感芯片是检测成本居高不下的重要因素。据此，多个实验室已经开展传感芯片循环再生的相关研究工作。

2.2 荧光生物传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

荧光传感器是通过测定特征荧光光谱对被测物进行定性和定量检测，能将分子识别事件通过荧光信号有效的表达，该传感器在灵敏度和选择性等方面具有突出的优势[15]。大多数无机化合物本身并不发荧光，还有一些物质本身的荧光强度不足以进行直接荧光分析，如某些蛋白质等，可将特定的荧光探针与这些物质形成复合物，利用该复合物所产生的荧光强度，对这些物质进行测定，从而扩大了荧光生物传感器的应用范围。

Huang等[16]采用光谱表面等离子-荧光增强（long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy LRSP-FS)传感器，多克隆抗体作为捕获抗体，标记了Alexa-fluorite-647的亲和纯化多克隆抗体作为检测抗体，通过三明治免疫法检测E.coli O157∶H7；LRSP的共振激发模式提供了一个高强度的电磁场，这种能量在检测目标物时起到增强荧光信号作用。该传感器检测时间为40 min，检测限为10 CFU/mL。Tao等[17]应用三明治免疫检测法联合荧光标记物Alexa-Fluor检测E.coli O157:H7。将多克隆抗体通过生物素—亲和素作用固定在聚苯乙烯纤维波导管上作为捕获抗体；与Alexa-Fluor 647共轭的抗体作为第二抗体，依据Alexa-Fluor 647的荧光信号对E.coli O157:H7进行检测。此传感器检测到纯培养的E.coli O157:H7最低检测限为103CFU/mL，人工接种的碎牛肉增菌4h就可检测出1 CFU/mL。虽然荧光生物传感器灵敏度很高，但在检测大部分物质时，需要将被测物进行标记，操作繁琐，操作条件要求严格，不适合进行现场检测。

3 压电生物传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

压电生物传感器是结合了压电效应的高灵敏性和生化反应的高特异性的一种生物传感器，主要由压电晶体和生物分子识别系统组成。当电压施加于压电晶体两侧的电极时，晶体会产生机械变形震荡。当电压频率达到晶体的固有频率时，振幅最大，形成压电谐振，此特定频率称为谐振频率，谐振频率与晶体的物理尺寸和性质密切相关。当晶体的表面沉积一定质量的物质,它的谐振频率就会发生改变。该频率的改变与其表面沉积物质的量之间存在一定线性关系。因此，如果晶体表面固定了生物识别分子，当被分析物与生物识别分子相结合就会引起谐振频率的变化，从而依据其响应信号对分析物进行检测。

3.1 石 英 晶 体 微 天 平 （Quartz Crystal Microbalance.QCM）在E.coli O157：H7检测中的应用

QCM最基本的原理是利用了石英晶体的压电效应，主要由石英晶体传感器、信号检测和数据处理等部分组成，具有结构简单、成本低、振动Q值大、灵敏度高、测量精度可以达到纳克量级的优点。石英晶体的介电和压电常数稳定性好，适合做工作温度范围很宽的传感器。

WANG等[18]基 于 QCM 采用逐层组装(polyelectrolyte layer-by-layer self-assembly，LBLSA)方法，将抗体固定到16巯基烷酸膜上，即一个尾端为羧基的烷烃硫醇长链，该膜是通过N2羟基琥珀酰亚胺作为媒介自组装到石英晶体的金电极表面。目标菌和抗体的结合使传感器共振频率降低，而频率的变化和细菌的浓度有关。通过QCM和循环伏安法可得到该生物传感器层层组装产生的性质变化。该法减少了检测时间，得到E.coli O157∶H7的最低检测限为2.0×102CFU/mL。Shen[19]应用生物素放大技术，引入信标免疫磁性纳米粒子 (beacon immunomagnetic nanoparticles，BIMPs)和链霉亲合素与金的复合物（streptavidin-gold），应用QCM对E.coli O157∶H7进行了高灵敏的检测。该检测利用磁纳米粒子耦合的生物素化抗体，在样品中捕获E.coli O157∶H7，经磁性分离后，得到了E.coli O157-BIMPs复合物，然后加入 streptavidin-gold与E.coli O157-BIMPs构成生物素-亲和素系统。最后混合液通入到已组装了单克隆抗体的QCM进行检测。由于纳米粒子、生物素-亲和素的增强作用，在缓冲液、牛奶中分别检测E.coli O157∶H7的灵敏度可达到23 CFU/mL、53 CFU/mL。谌志强等[20]基于QCM利用磁纳米粒子与金纳米粒子的增强响应信号对E.coli O157∶H7进行检测。采用滴加的方法，分别将磁纳米粒子和金纳米粒子滴加在捕获了E.coli O157∶H7的芯片表面，通过对比每一步的响应信号及其总响应信号，考查其增强效果，结果表明QCM在没有两种纳米颗粒的放大作用下，其检测限为104CFU/mL，而经过两级放大后，检测下限达到10 CFU/mL。QCM的成本相对较高、耗时长等原因而没有在实际应用中得到广泛的应用。

3.2 其他压电生物传感器在E.coli O157∶H7检测中的应用

基于上述压电传感器的基础，研究人员发展了其他技术来检测E.coli O157:H7。Mao等[21]利用QCM DNA传感器进行E.coli O157∶H7的检测，首先将E.coli O157:H7 eaeA基因的单链探针自组装在QCM芯片表面，再与其生物素化的互补链杂交，然后加入与链霉亲和素标记的磁纳米粒子来增强响应信号，得到E.coli O157∶H7检测限为2.67×102CFU/mL，检测范围为2.67×102～2.67×106CFU/mL。Poitras等[22]采用石英晶体损耗检验微天平 (QCM with dissipation monitoring, QCM-D)检测E.coli O157∶H7，结果显示检测不同浓度的E.coli O157∶H7时，QCM-D耗散因子的变化比频率变化更灵敏，检测范围是3×105～1×109cells/mL。

4 电化学生物传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

电化学生物传感器是指由生物材料作为敏感元件，电极（固体电极、离子选择性电极、气敏电极等）作为转换元件,利用待测物的电化学性质，并将待测物化学量转变成电信号进行检测的一种传感器。电化学生物传感器既能满足一般检测所需要的灵敏度和准确性，又具有体积小、操作简单、携带方便等特点，可用于现场检测。依据产生信号的不同，电化学传感器可以分为阻抗型传感器、电流型传感器、电压型传感器等。

4.1 阻抗传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

电化学阻抗传感器是一种以小振幅的正弦波电位（或电流）为扰动信号的化学测量方法。由于以小振幅的电信号对体系扰动，一方面可避免对体系产生大的影响，另一方面也可以使得扰动与体系的响应之间近似成线性关系，从而使测量结果的数学处理变得简单。同时，电化学阻抗方法又是一种频率域的测量方法，它以测量得到的频率范围很宽的阻抗谱来研究电极系统，因而能比其他常规电化学方法得到更多的动力学信息及电极界面结构的信息[23]。

李杜娟等[24]将抗体固定在A蛋白修饰的石英晶体金电极表面，采用三电极系统，即工作电极（石英晶体金电极）、参考电极（Ag/AgCl/Cl-）和铂对电极，应用电化学阻抗生物传感器快速检测了E.coli O157：H7。 结果表明，在[Fe(CN)6]32/42氧化还原对存在的情况下，抗体的固定以及抗原与抗体的结合都增加了石英晶体金电极表面的电子传递阻抗，且石英晶体金电极的电子传递阻抗变化值与E.coli O157：H7的浓度在一定范围内呈线性关系，检测限是103CFU/mL，检测时间不超过10 min。Varshney等[25]将金交叉式阵列微电极与磁性纳米粒子相结合应用于阻抗传感器，快速检测了牛肉样品中的菌体，可检测到1.2×103cells的E.coli O157:H7，整个检测过程只需要35 min。Li等[26]利用金纳米粒子与壳聚糖多壁碳纳米管复合物和SiO2/硫堇，将其逐层自组装于电极表面，从而增强了阻抗传感器的灵敏度，使得E.coli O157:H7的检测线性范围达到4.12×102～4.12×105CFU/mL，整个检测过程少于 45 min。Majed等[27]基于交叉指型微金电极(interdigitated microelectrode，IME)阻抗传感器检测E.coli O157: H7。该方法不是利用抗原抗体结合进行检测的，而是通过阻抗的改变值计算电极表面附着E.coli O157:H7的量。阻抗值的频率范围是100 Hz～10 MHz，E.coli O157:H7检测范围是2.5×104～2.5×107CFU/mL。

4.2 电流型传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

电流型传感器是通过设定一定值的电位，被测物直接或者间接的与电极表面的识别分子发生反应，从而引起电流的变化，通过电流的改变可以得出被测物的反应情况与反应物质的量。

Setterington等[28]将E.coli O157:H7用免疫磁珠从样品中磁性分离后，引入到生物功能化的导电聚苯胺 （immuno-PANI)修饰的工作电极表面，利用循环伏安法检测E.coli O157:H7。基于聚苯胺的放大信号作用，检测最低限为7 CFU（原始的浓度70 CFU/mL）。整个过程从取样到检测仅需要70 min。从电流型传感器研究的情况来看，目前仍在寻找更合适的固定方法和固定材料，探求更灵敏稳定的标记体系和电活性物质，追求更完美的信号检出系统。

5 其他传感器在E.coli O157：H7检测中的应用

除了上述生物传感器对E.coli O157：H7进行检测，目前也发展了一些其他传感器检测方法，如李延斌等[29]利用不同长度微流体通道，基于微流体晶片的光学生物感应方法检测E.coli O157：H7，检测限达到10～100 cell/mL，并且不采用增菌手段，检测在2 h内完成。马静等[30]建立了一种快速检测E.coli O157：H7的新型酶免疫传感器，利用静电吸附作用和抗原抗体特异性结合将E.coli O157:H7单克隆鼠抗固定在辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG/纳米金修饰的玻碳电极表面，制备了用于检测E.coli O157：H7的酶免疫传感器。检测下限为1×102CFU/mL,检测线性范围是1×103～1×105CFU/mL。Luo等[31]采用基于静电纺丝技术的电导型传感器检测了 E.coli O157:H7。将E.coli O157:H7多克隆抗体固定在经过静电纺丝纳米膜修饰的传感器表面。再将磁纳米粒子标记的抗体与待测样品充分混合，经磁性分离纯化后，通入到传感器进行检测。整个检测时间8 min，检测限为61 CFU/mL，在10 CFU/mL～104CFU/mL范围成线性关系。

6 总结和展望

生物传感器的问世使得微生物检测过程变得更为简单，且容易实现现场快速检测。但是，目前一些生物传感器还存在一些方面的限制。比如：①灵敏度还需要进一步提高。目前实验室研究的E.coli O157:H7检测限都在103CFU/mL左右，而实际应用要求检测限要达到个位数;②目前大多数生物传感器检测E.coli O157:H7，其特异性主要依赖于抗体，需进一步研发其它特异性识别分子，以降低检测成本；③生物传感器的使用寿命还需要进一步延长。随着微电子技术、材料学、生物技术、信息技术的快速发展，上述问题均会得到改善。在食品中E.coli O157:H7检测方面，生物传感器必将成为一种简便、快速、灵敏的现代检测技术。

[1]TARR PI,NEILL MA.Escherichia coli O157:H7[J]. Gastroenterology Clinics of North America,2001,30(3): 735~751.

[2]AHN K C,KLEIN E,TARR I P.Isolation of patients acutely infected with Escherichia coli O157:H7:lowtech,highly effective prevention of hemolytic uremic syndrome[J].Clin Infect Dis,2008,46(8):1 197~1 199.

[3]王燕,谢桂林,杜琳.大肠杆菌O157:H7感染流行概况[J].微生物学免疫学进展,2008,36(1):51~58.

[4]TOMBELLI S,MASCINI M,SOCA C,et al.A DNA piezoelectric biosensor assay coupled with a polymerase chain reaction for bacterial toxicity determination in environmental samples[J].Analytica Chimica Acta,2000, 418(1):1~9.

[5]CAMPANELLA L,CUBADDA F,SAMMARTINO M P,et al.Analgal biosensor for the monitoring of water toxicity in estuarine enviraonments[J].Water Research,2001, 35(1):69~76.

[6]SHANKARAN D R,GOBI K V,MIURA N.Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical,food and environmental interest[J].Sensors and Actuators B: Chemical,2007,121(1):158~177.

[7]RICH R L,MYSZKA D G,BIACORE J.A new plat form for routine biomolecular interaction analysis[J].Journal of Molecular Recognition,2001,14:223~228.

[8]林钊,刘霞,李迎.表面等离子体共振技术在农药残留检测研究中的应用[J].食品科学,2011,32(5):342~ 349.

[9]殷涌光,葛晶,于庆宇,等.利用胶体金复合抗体提高SPR生物传感器的微生物检测精度[J].吉林大学学报(工学版),2005,35(4):446~450.

[10]王凯,殷涌光.SPR生物传感器在食品安全领域的应用研究[J].传感器与微系统,2007,26(5):12~17.

[11]WANG YI XIAN,YE ZUN ZHONG,SI CHENG YAN,et al.Subtractive Inhibition Assay for the Detection of E. coli O157:H7 Using Surface Plasmon Resonance[J]. Sensors,2011,11:2 728~2 739.

[12]WANG YI XIAN,YE ZUN ZHONG,SI CHENG YAN,et al.Monitoring of Escherichia coli O157:H7 in food samples using lectin based surface plasmon resonance biosensor[J].Food Chemistry,2013,136:1 303~1 308.

[13]NANCY TAWIL,EDWARD SACHER,ROSEMONDE MANDEVILLE,et al.Surface Plasmon resonance detection of E.coli and methicillin-resistantS.aureus using bacteriophages[J].Biosensors and Bioelectronics,2012, 37:24~29.

[14]EUM NYEON SIK,YEOM SE HYUK,KWON DAE HYUK,et al.Enhancement of sensitivity using gold nanorods—Antibody conjugator fordetection of E.coli O157:H7[J].Sensors and Actuators B:Chemical, 2010,143:784~788.

[15]黄政.光学生物传感器的应用及进展[J].中国科技信息, 2011,7(13):37~38.

[16]HUANG CHUN JEN,JAKUB DOSTALEK,ANAELA SESSITSCH,et al.Long-Range Surface Plasmon-Enhanced Fluorescence Spectroscopy Biosensor for Ultrasensitive Detection of E.coli O157:H7[J].Analytical Chemistry,2011,83:674~677.

[17]TAO GENG,JOE UKNALIS,TU SU I,et al.Fiber-Optic Biosensor Employing Alexa-Fluor ConjugatedAntibody for Detection of Escherichia coli O157:H7 fromGround Beef in Four Hours[J].Sensors，2006,6：796~807.

[18]WANG LI JIANG,WU CHUN SHENG,HU ZHAO YING,et al.Sensing Escherichia coli O157:H7 via fre-quency shift through a self-assembled monolayer based QCM immunosensor[J].Zhejiang University SCIENCE B，2008，9(2):121~131.

[19]SHEN ZHI QIANG,WANG JING FENG,QIU ZHI GANG,et al.QCM immunosensor detection of Escherichia coli O157:H7 based on beacon immunomagnetic nanoparticles and catalytic growth of colloidal gold [J].Biosensorsand Bioelectronics,2011,26：3 376~ 3 381.

[20]谌志强,王景峰,邱志刚,等.基于免疫纳米颗粒强化的压电免疫传感器检测大肠杆菌O157:H7[J].微生物学报,2009,9(6):820~825.

[21]MAO X L,YANG L J,SU XL,et al.A nanoparticle amplification based quartz crystal microbalance DNA sensor for detection of Escherichil coli O157:H7[J].Biosensors and Bioelectronics，2006,21(7),1 178~1 185.

[22]POITRAS C,TUFENKJI N.A QCM-D-based biosensor for E.Coli O157:H7 highlighting the relevance of the dissipation slope as a transduction signal[J].Biosensor and Bioelectronics,2009,24(1):2 137~2 142.

[23]曹楚南,张鉴清.电化学阻抗谱导论[M].北京：科学出版社,2003.

[24]李杜娟,王剑平,盖玲,等.快速检测大肠杆菌O157: H7的电化学阻抗免疫生物传感器[J].传感技术学, 2008,21(5):708~714.

[25]MADHUKAR VARSHNEY,LI YAN BIN,BALAJI SRINIVASAN,et al.A label-free,microfluidics and interdigitated array microelectrode-based impedance biosensor in combination with nanoparticles immunoseparation for detection of Escherichia coli O157:H7 in food samples[J].Sensors andActuators B:Chemical,2007,128 (1):99~107.

[26]LI YAN,CHENG PING,GONG JUNHUA,et al.Amperometric immunosensor for the detection of Escherichia coli O157:H7 in food specimens[J]．Analytical Biochemistry, 2012,421:227~233.

[27]MAJED DWEIK,R CODY STRINGER,SHIBAJYOTI GHOSH DASTIDER,et al.Specific and targeted detection of viable Escherichia coli O157:H7 using a sensitiveand reusable impedance biosensor with dose and time response studies[J]．Talanta,2012,94:84~89.

[28]SETTERINGTON,EMMA B,ALOCILJI,EVANGELYN C.Rapid electrochemical detection of polyaniline-labeled Escherichia coli O157:H7[J]．Biosensors&Bioelectronics，2011，26(5)：2 208~2 214.

[29]LI YAN BIN,SU XIAO LI.Microfluidics-Based Optical Biosensing Method Forrapid Detection of Escherichia Coli O157:H7[J].BioDetection Instruments LCC，2005，5：96~109.

[30]马静,张伟尉,李闻,等.基于纳米金固定大肠杆菌O157:H7酶免疫传感器的研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(12):2 156~2 173.

[31]LUO YI LUN,NARTKER STEVEN,WIEDERODER MICHAEL,et al．Novel Biosensor Based on Electrospun Nanofiber and Magnetic Nanoparticles for the Detection of E.coli O157:H7[J].Nanotechnology,2012,4(11): 676~681.

Application of the biosensor for detection E.coli O157:H7

Li Rong-zhuo，Liu Xia*，Li Lei，Li Wen-jin
(College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

Biosensor has been widely applied in various fields owing to its simplicity,rapid,strong specificity,and high selectivity.Escherichia coli O157:H7(E.coli)is an important enterohemorrhagic pathogen,which is considered to be the very dangerous.The food-borne diseases have frequently broken out as a result of E.coli O157:H7 in the world.At present,E.coli O157:H7 has become a global public health problem.Therefore,the study of detection method for E.coli O157:H7 has become a hot spot in the area of food safety.This article provides an overview of biosensor for detection E.coli O157:H7.

E.coli O157:H7;biosensor;detection

国家自然科学基金(31201375)；湖南省教育厅优秀青年项目(10B050)

*通讯联系人，E-mail：liuxiaspr@gmail.com