培养法和染色法对养殖环境中微生物气溶胶浓度的检测

刘畅

(鞍山市产品质量监督检验所，辽宁 鞍山 114006)

大气气溶胶当中，生物气溶胶是其中具有活性的部分，包括细菌、真菌以及病毒等等，其以空气为介质进行传播和扩散，从而引发人类的急性、慢性疾病，例如传染、中毒、过敏或者植物疾病的流行以及传播。畜禽舍环境当中所产生的微生物气溶胶不仅将对畜禽以及相关人员的健康带来危害，同时也将对外界的环境带来污染。许多重大畜禽类型的传染病将是通过气溶胶进行传播的。

微生物气溶胶浓度检测可使用多种方法，传统的方法是培养之后的菌落技术，当前，随着分子生物学研究的进步，可使用DNA染色后直接镜检技术以及荧光原位杂交、定量PCR技术等等，当前最常用的是培养后的菌落技术，然而该方法无法对微生物的实际含量进行准确地计算，根据实际的报道可了解，仅有0.3%～10%的微生物能够被培养。DAPI染色法已经被认定为标准的检测浮游生物总量的方法，同时其操作较为简便，能保证技术的准确性。

一 试验材料以及试验方法

1.采集样品

本实验分别对1个猪舍、2个鸡舍、2个牛舍进行了检测，通过将国际标准AGI-30空气采样器放置在畜禽舍的中间，使其离地约为1.0m，以50m l的无菌生理盐水为采样介质，采样过程当中的气流速度为12.5L/min，驱动时间为20min。在采样的过程中同时对舍内的温热指标进行记录。

2.培养计数法

取25ml空气采样液进行摇匀，而后将采样液均匀分为三份，一份以包含有50mL/L绵羊血的营养琼脂作为培养基，从而实现需氧细菌的培养，而另一份则依旧包含体积分数为5%的绵羊血的营养琼脂作为培养基，从而实现厌氧细菌的培养。而第三份则以沙保弱作为培养基，从而实现真菌的培养，每个样品重复三次。细菌在恒温37℃的培养箱中培养24h～48h后开始计数，真菌在恒温25℃的培养箱中培养3～7d后进行技术，校正之后用于生物气溶胶浓度的计算。

3.DNA染色后计数

通过预先经过铬酸浸泡以及高压灭菌处理之后的25mL采样液放入50mL玻璃瓶当中，随后加入5mL福尔马林，再加入7.5mL DAPI染液，而后将采样液置于暗室中染色10min，最后在低于0.07大气压状况下使用硝酸纤维滤膜抽滤采样液，抽干之后取出硝酸纤维滤膜，将其置于滴上镜油的载玻片上进行计数。每一个细胞代表一个微生物气溶胶粒子。

二 试验分析

1.DAPI染色后的计数结果

使用DAPI染色法所测试得出的不同养殖环境下的微生物气溶胶浓度如下图所示:

畜禽舍(编号)不同计数方法微生物的浓度AGI-30/(105 cfu/m3) DAPI染色(106 cell/m3) Median Max Min Median Max Min鸡舍A 38.9 67.2 13.8 166 325 19.2鸡舍B 27.1 43.3 14.7 166 275 8.90猪舍C 26.3 40.1 15.6 136 228 5.55牛舍D 2.09 3.08 1.14 8.36 15.7 0.93牛舍E 5.92 83.2 3.07 37.3 59.3 10.4

不同养殖环境下的微生物气溶胶浓度为166×106、166×106、136×106、0.836×106、3.73×106个/m3空气。通过在荧光显微镜下观察可了解到，每个视野当中被染色的微生物最合适的数量为30～60个，过多或者过少都将导致计数产生偏差。由此，在显微镜观察之前应将采样液进行适当的稀释，同时抽滤过程中选择合适的样品数量。

2.培养法测试得出的气溶胶浓度

通过AGI-30采样器对不同养殖环境内的微生物气溶胶浓度检测结果分别为采样器对2个鸡舍、1个猪舍和2个牛舍38.9×105cfu/m3、27.1×105cfu/m3、26.3×105cfu/m3、2.09×105cfu/m3、5.92×105cfu/m3。对于鸡舍A、B而言，在经过AGI-30采样器进行样品的采集之后，培养计数法所测试得出的浓度仅仅占据DAPI计数法所得出浓度的2.34%和1.63%，猪舍C、牛舍D、E所培养得出的微生物浓度占DAPI染色计数法得出浓度的1.93%，2.50%和1.59%。

三 结论

对于复杂的介质而言，由于介质当中包括有使DNA粘连或者存在抑制酶反应的物质，从而导致DNA的克隆结果无法对真实的状况进行反映，通过使用荧光定量PCR技术，能实现对特定微生物含量计量的技术，然而该技术对试验操作人员的要求较高，试验的成本也较高，该种技术可对已知的特定微生物的定量定型分析进行检测。DAPI在染色后的直接荧光镜计数操作较为简单方便，无论是活细胞还是死细胞、残核细胞都能清楚地检测出来，从而得出了一个客观真实的数据，是对某种环境下微生物总量检测的较为便捷、快速有效的检测方式。

在畜禽养殖环境下，微生物气溶胶来源以及成分都较为复杂，不同的微生物种类所需要培养的条件以及营养的成分都各有不同，由此，通过传统的培养方式能培养出的微生物的数量以及种类都十分有限，同时，即使可培养的微生物也不一定能全部培养成功。由此，传统的培养方法仅仅只能在一定的条件下实现对微生物的检测，难以对微生物的实际状况进行分析和检测，从而在很大程度上对试验结果的分析和判断造成了影响。

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