采后壳聚糖处理对果实-病原菌互作中形态结构的影响

张 璐，曾凯芳,2,*

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.西南大学 国家食品科学与工程实验教学中心，重庆 400716)

目前，大量合成杀菌剂被用于控制果实采后病害，由于公众和学者越来越重视合成化学物质在食物链的积累问题，我们急需找到一些方法替代化学杀菌剂。壳聚糖(chitosan)学名为β-(1,4)聚-2-氨基-D-葡萄糖，来源于真菌细胞壁及介虫(蟹、虾)外壳，是甲壳素的脱乙酰产物，具有安全、无毒、抑菌、可食及生物降解等多种特性。壳聚糖具有延缓果实成熟衰老、直接抑菌、作为激发子诱导果实抗性的功能，目前壳聚糖在控制采后病害中具有很大潜力，它对许多园艺产品采后病害控制都有效果，如苹果、覆盆子、梨、番茄、猕猴桃、草莓、甘椒、黄瓜、桃、荔枝等[1-5]，目前已用于延长果蔬货架期。壳聚糖的抑菌功能与其质量浓度、分子质量、脱乙酰度及果实的种类密切相关，如1%或2%壳聚糖对控制采后青霉菌(Penicillium expansum)侵染苹果有效果[5]，质量浓度1g/100mL、分子质量小于5×104u的壳聚糖对控制采后甜樱桃腐败效果更好[6]。通过基团的化学修饰而制备的壳聚糖衍生物具有比壳聚糖更好的溶解性或抑菌性[7-9]。

用壳聚糖处理采后果蔬，壳聚糖、受病害感染的果实及病原菌在相互作用、相互识别的过程中，形成了一种错综复杂的关系。第一，病原菌侵染果实，从而获取营养，对果实的结构和生理代谢产生影响；第二，病原菌的侵染激发了果实自身的抗病能力，可以在一定程度上抵抗外界各种胁迫对果实造成的不良影响；第三，壳聚糖不但能直接作用于病原菌，影响它的侵染能力，也能作为一种天然信号分子，引起果蔬组织内一系列抗性相关防卫反应的发生。目前对壳聚糖控制果实病害的研究多从其防治效果、对病原菌的抑菌机理、提高果实抗病性等方面单独入手，而壳聚糖发挥作用是壳聚糖-果实-病原菌三者共同相互作用的结果，因此本文从互作的角度，通过最直观的形态结构变化来说明壳聚糖在控制采后果实病害中的作用。

1 壳聚糖与采后果实-病原菌的互作关系

病害的发生往往是病原菌与寄主相互作用的结果。病原菌侵入果实多是通过皮孔或微伤口潜入到果实内部，在组织、细胞及亚细胞水平可观察到一系列的病理变化，这些变化因病原菌的寄生性的差异而不同。病原菌的致病途径主要有破坏宿主细胞结构、产生宿主细胞壁降解酶、产生毒素、影响植物激素、影响宿主基因组功能等[10]。在果实-病原菌互作中，受病原菌诱导，引起果实体内病组织或临近组织中生理功能及生物能量的改变。果实有预存和诱导两类防卫系统。前一系统的成分是细胞壁的角质、蜡质、木质素、栓质、特殊气孔结构、小分子抗病物质、种子预存的抗真菌蛋白和能与真菌几丁质结合的凝集素、破坏真菌细胞透性的蛋白质、核糖体失活蛋白等。后一系统是植物的基本防卫系统，它又分为局部的抗病反应和系统的抗病反应两类。果实在抵御病原菌的过程中会发生细胞结构改变[11-12]，木质素的产生，保卫素的合成和积累，抗性酶(过氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polygalacturonase，PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL))与活性氧相关酶系、编码病程蛋白酶系、酚类物质、其他种类物质以及能量的变化等。通过这些形态、生理、生化水平的变化，果实才能够抵御病原菌的侵染。

壳聚糖对果实病害的防治机制主要有：1)壳聚糖的抑菌性。目前的研究表明，酸性条件下，壳聚糖分子上的—NH2质子化而带正电荷，可以与带负电的细胞或带负电的物质(如蛋白质等)相互作用，吸附在病原菌细胞表面，改变其细胞内外正常电化学势，影响细胞膜正常的生理功能，干扰病原菌正常的新陈代谢活动[13]；2)壳聚糖的诱导果实抗病性。壳聚糖在一定程度上诱导果蔬组织木质素、植保素以及其他抗菌物质(如酚类、脂肪酸等)含量升高，影响果实细胞壁、皮孔等结构的变化，阻碍病原菌的侵袭[14]；3)壳聚糖的成膜性，壳聚糖在果实表面形成一层天然屏障，阻碍病菌的侵入，同时通过调节果实生理代谢延缓衰老，降低发病率。研究显示，1.5%壳聚糖包膜处理草莓后果实无明显真菌病害的发生，并显著降低草莓的衰老[15]。这3种机制都离不开壳聚糖-果实-病原菌三者的相互作用。壳聚糖直接影响病原菌入侵的途径，使其形态发生变化，影响其在果实组织中的发育过程，另一方面诱导果实产生抗性，抗性相关物质含量增加，细胞发生形态变化以抵御病原菌的入侵。

2 壳聚糖对果实-病原菌互作中病原菌形态结构的影响

2.1 对病原菌形态结构的直接影响

壳聚糖对病原菌有直接抑制作用，已有的生化和超微结构的研究都表明，壳聚糖的抑菌主要原因可能是使菌体细胞膜功能丧失(改变病原菌细胞膜的流动性和通透性)和菌体细胞壁破坏。不同分子质量的壳聚糖对各种植物病原菌的生长以及植物病原真菌孢子萌发形成菌丝体都有明显的抑制作用。这种抑制作用的强弱，因壳聚糖的分子质量、浓度、脱乙酰度等及植物病原菌的不同而各有差异。Cheah等[16]用扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)观察了壳聚糖处理对胡萝卜上核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌丝的影响，发现菌丝形态变畸形(扭曲和分枝)、菌丝死亡(细胞质消失)。Benhamou[17]研究了壳聚糖对引起番茄腐败的Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici的生长、形态学和超微结构的影响，用光学显微镜观察到壳聚糖引起菌丝膨胀和变形。Bautista-Banos等[18]报道，壳聚糖处理使病原菌菌丝膨大卷曲，被疏松的细胞壁包裹。Sánchez-Domínguez等[19]通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察到经壳聚糖处理后A. alternata孢子和菌丝体超微结构变化，这和壳聚糖的抑菌作用有关，病原菌发生细胞质分裂、原生质膜收缩、孢子崩解和质壁分离等变化。Barka等[20]和El Hassni等[21]报道壳聚糖能使灰霉菌(Botrytis cinerea)和Fusarium oxysporum f. sp. albedinis菌丝形成大囊泡或者细胞变空失去细胞质。对真菌孢子进行碘化丙锭(propidium iodide，PI)染色发现，25℃条件下5000μg/mL壳聚糖对B.cinerea和P.expansum孢子的质膜均有明显的破坏作用，并且处理时间越长，质膜损伤程度越高[22]。

壳聚糖的抑菌作用是其在病原菌细胞外和细胞内共同作用的结果。在细胞外，由于壳聚糖为甲壳素的多聚阳离子衍生物，能与病原菌细胞表面的生物大分子带负电的侧链相互作用，形成聚合物成为物理屏障，阻碍细胞内外正常代谢和物质交换，影响病原菌细胞膜的流动性和通透性，影响细胞质膜完整性，造成胞内物质渗漏，进而抑制病原菌的生长。廖春燕[23]在壳聚糖对番茄枯萎病菌的拮抗作用研究中发现，0.5mg/mL壳聚糖处理1h，番茄枯萎病菌菌丝的渗透率为29.57%(对照仅5.24%)；在壳聚糖处理90min后，菌丝的电解质渗透最为明显。Palma-Guerrero等[24]以粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)为模型研究了壳聚糖使其质膜渗透率增加、细胞死亡和溶胞的过程，发现壳聚糖使病原菌细胞渗透率增加和被吸收进入病原菌细胞是一个耗能的过程，且不同的细胞类型(分生孢子、芽管、营养菌丝)对壳聚糖的敏感性不同。El Ghauth[25]报道壳聚糖处理增加了匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)和B. cinerea细胞渗透率，说明细胞膜、细胞壁受到损坏。Liu Hui等[26]通过检测培养基中的β-半乳糖苷酶的活性，检测细胞渗出物在260nm波长处的吸收度以及检测荧光探针NPN的荧光强度的变化等多种手段证明，壳聚糖对细胞内膜和外膜的完整性均造成破坏。在超微结构上，研究发现壳聚糖处理对病原菌细胞的形态影响。以上研究都表明，在壳聚糖的作用下，病原菌细胞发生物质渗漏，膜完整性受到破坏。壳聚糖目前普遍认为大分子质量的壳聚糖可能主要是通过在胞外发挥作用起抑菌作用的，但对细胞质膜的破坏作用尚缺乏系统直观的研究[27]。

在细胞内，壳聚糖作为信号分子，诱导细胞内发生一系列的生化反应，或直接进入细胞作用于胞内物质。Benhamou[17]在超微结构上发现壳聚糖处理的细胞发生质膜变化、细胞质显著凝聚。Li Yongcai等[28]报道，壳聚糖处理引起细胞质异常分布、细胞器无膜、细胞壁变厚等变化，高质量浓度的壳聚糖能使细胞严重损伤，包括细胞膜、细胞壁破裂、细胞质流出。目前已有人将壳聚糖低聚物进行标记，研究壳聚糖进入病原菌细胞后的作用，Xu Junguang等[29]提取的胞内核酸在体外进行凝胶阻留实验的结果表明壳寡糖能够与DNA和RNA紧密结合，壳聚糖(尤其是低聚物)很有可能是进入细胞后与细胞内的特定靶物质(如核酸)相互作用，引起胞内物质紊乱，进而起到杀菌作用。

随着壳聚糖的抑菌机理备受关注，虽然目前普遍认为壳聚糖在胞外的作用是其抑菌的主要机制，但是其在胞内的作用也不容忽视，今后应该对其进入细胞的方式，细胞内存在壳寡糖的受体和作用位点，及其在细胞内的信号转导等进行更深入的研究。

2.2 对病原菌形态结构的间接影响

壳聚糖除了有直接抑菌作用外，还能通过影响果实分泌对病原菌起拮抗作用的小分子次生代谢产物如植保素或抗毒素，以及能分解病原菌细胞壁的胞壁降解酶，从而对病原菌形态结构产生间接影响。这些物质由果实组织产生释放出来，作用于病原菌细胞，对其形态结构产生破坏。

对病原菌作用的主要胞壁降解酶有：1)壳聚糖酶能水解病原真菌的细胞壁，抑制病原物生长，产生新的激发子诱导植物一系列防御反应。钟秋平[30]研究了采前喷施壳聚糖对采后接种处理毛叶枣果实腐烂的影响，得知4mg/mL壳聚糖可诱导毛叶枣壳聚糖酶较对照升高23.4%。2)几丁质酶(chitinase，CHI)的天然底物是几丁质，而许多植物病原真菌细胞壁的主要成分是几丁质，因而几丁质酶对病原菌细胞壁具有降解作用，几丁质酶是病程相关蛋白(PR)的重要组成部分，在植物抗病中除具有直接抑制病菌的作用外，还有从病菌壁上释放激发子的作用。李美芹[31]测试了不同分子质量的壳聚糖对番茄叶霉病的作用，结果表明，3、82、213kD的壳聚糖能诱导番茄几丁质酶较对照升高95.5%、263.3%、242.7%。3) β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，GLU)也是病程相关蛋白(PR)的一种，它可通过对病原菌菌丝的直接裂解作用，促进病原菌细胞壁裂解和植物酚类物质的合成，从而抑制病原菌的进一步侵染[32]。李美芹[31]观察不同质量浓度的壳聚糖对番茄叶霉病的作用结果发现，3mg/mL和6mg/mL壳聚糖可诱导番茄β-1,3-葡聚糖酶较对照升高117.6%和428.0%。壳聚糖处理增强了柑橘和草莓内CHI和GLU活性[33-34]。Meng Xianghong等[35]研究发现壳聚糖处理后，梨果实GLU活性明显增加。

这些形态和物质的变化使得病原菌失去侵染能力或者侵染力减弱，从而保护了果实组织。但是，病原菌对壳聚糖也会产生一些防御反应，如形成子菌丝的细胞质变稠密，细胞壁变厚等。Benhamou[17]发现了病原菌细胞中几丁质等非结晶的物质发生异常沉积，β-1,3-葡聚糖酶和脱乙酰几丁质酶活性增强。几丁质等物质合成增加的生理学意义可能是平衡细胞壁改变和质膜逐渐收缩所形成的压力。

虽然不同研究者从各个角度探讨了特定分子特征壳聚糖对不同种属病原微生物细胞结构和生理代谢的影响，但缺乏系统性的研究。今后应在利用荧光或胶体金标记壳聚糖研究其作用部位以及对细胞膜的影响方面加强研究[27]。

3 壳聚糖对果实-病原菌互作中果皮细胞结构的影响

3.1 对果皮细胞结构的直接影响

果实的细胞壁可以维持细胞具有一定形状，还可以保护原生质体，对外界病原菌微生物的入侵具有一定的抵抗作用。它是植物抵御外来侵染的第一道有效屏障，当病原物侵染时，细胞壁部分被破坏，诱使植物细胞对细胞壁进行修复，加速非蛋白性物质在细胞壁的沉积，细胞壁加厚并木质化。果实在受到病原微生物侵染时，在菌丝与寄主细胞接触的寄主细胞与质膜之间，常有胞壁沉积物的形成，它是抵抗病原菌侵染的重要防卫系统之一，并且增强了寄主细胞壁对病菌入侵的抵御能力，沉积物中往往存在着大量的纤维素、半乳糖、β-1,3-葡聚糖等成分。壳聚糖处理能使果实果皮细胞壁变厚，促进木质化，更利于抵御病原菌的入侵。Nicole等[36]用壳聚糖处理番茄，当镰刀菌入侵时，番茄细胞壁显著加厚，胞间被填塞。

寄主植物在受到病原菌侵染时，寄主细胞在侵染点处要分泌类似于胞壁沉积物的物质，即乳突结构，一般位于植物细胞壁与质膜之间。乳突的形成与病原菌的侵染密切相关，乳突可能具有物理的和化学的抑制病菌入侵的作用，即乳突性。Nicole等[36]用研究发现用壳聚糖处理的番茄，果皮细胞在病菌侵入处形成大量乳头状突起，病原菌被包埋在致密的颗粒状物质中，不能进一步扩散，而且颗粒状物质中似乎还有杀菌物质产生，使植物对病原菌产生了有效的抗性。

木质素是一种重要的物理抗菌物质，它的形成和松柏醇产生的甲基化醌与HRGP之间的共价交换有关，植物抗病激活剂的诱导导致木质素在细胞壁沉积而构成致密、不易穿透的屏障，阻止了病菌的生长繁殖，从而保护细胞免受侵害[37]。木质素是由4种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种复杂的酚类化合物，它与纤维素、半纤维素一起构成植物骨架的主要成分，木质素沉积于细胞壁，并以共价键与细胞壁结合。钟秋平[30]在研究采前喷施壳聚糖对提高毛叶枣抗病能力时发现，壳聚糖处理的果实在整个成熟过程中木质素含量都明显高于对照，木质素含量随着果实成熟度的增加而逐渐增加。研究表明[38]，壳聚糖处理的马铃薯块茎中黄酮类物质和木质素含量增加。PAL是苯基丙酸类合成路径的第一个酶，并和酚类化合物、植保素、木质素合成有关。有报道[39]，壳聚糖处理后的小麦叶中PAL的活性、木质素的含量都有所上升。Vasconsuelo等[40]也在欧茜草细胞培养实验中证实壳聚糖可诱导植物细胞壁木质化。

富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)是高等植物中特有的一种结构蛋白，其特点是羟脯氨酸含量高达30%～40%，HRGP可在被各种病原物侵染的植物中积累，也可被各种诱导因子所诱导。HRGP也是细胞壁中木质素沉积的位点，木质素也是植物体内的一种重要的物理抗菌物质，它与HRGP一起作为结构屏障物，起加固细胞壁的作用。周自云等[41]用0.1mL 30%壳聚糖诱导杨树愈伤组织，发现壳聚糖处理的愈伤组织HRGP含量呈现持续增加的趋势，在壳聚糖处理96h后含量达最高(74μg/mg)，较空白对照增加了1.1倍。

据报道[42]，壳聚糖能诱导侵染局部和整个植株系统性发生一系列反应，包括信号传递、病原相关蛋白及抗菌成分的聚集和激活。壳聚糖在植物体内诱导作用的机制可能分为2步，首先，植物组织细胞内具有识别和接受壳聚糖刺激信号的特殊受体，对壳聚糖进行分子识别，通过构型变化激活胞内有关酶的活性；其次修饰胞内基质后产生激活性和适应性的信号分子，并通过对特殊基因的调节激发组织细胞产生防卫反应。除了诱导果实生成抗性相关物质外，壳聚糖处理还引起果实体内形态学上的变化，通过促进果实木质素、植保素的合成来增加果实细胞壁抗真菌穿透的能力，从而提高果实的抗病反应能力。另外，壳聚糖处理果实后，经常会在侵入点附近黏着，此现象的主要功能除了形成物理屏障外，还能引起周围组织发生过敏反应，并伴随有H2O2的积累，诱导植物细胞壁增厚，这对植物其他健康组织是一个警示信号[43]。

3.2 对果皮细胞结构的间接影响

病原菌穿过细胞壁是通过分泌细胞壁水解酶直接突破果实表皮防御机制，造成细胞壁果胶、纤维素等的降解，引起果皮组织结构塌陷、崩解，借此力量侵入宿主细胞，并通过降解的植物细胞壁多聚体成分获得养分。根据酶作用的底物，可将病原菌分泌的细胞壁水解酶分为以下几种：角质酶(Cutinase)破坏植物体表面的角质层；果胶酶(Pectinase)破坏植物细胞的中胶层，其中果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)、果胶甲酯酶(PMG)以及果胶裂解酶(Pectate lyase，PE)等；纤维素酶(Cellulase)降解细胞壁纤维丝；半纤维素酶(Hemicellulase)；蛋白酶(Protease)，蛋白质可作为细胞膜成分和植物细胞结构成分，因此寄主蛋白质被病原物质分泌的蛋白酶降解可严重影响到寄主细胞的结构和功能。壳聚糖处理会影响病原菌胞壁降解酶的分泌，从而间接保护果实果皮的细胞结构。

El Ghaouth等[44]研究了壳聚糖处理对B.cinerea侵入甜柿子椒的过程的影响，特别是对病原菌降解果实细胞壁成分的影响。他们从B.cinerea感染组织中分离出了细胞壁组织浸解酶，这些酶和宿主细胞降解及果胶减少有关，其中果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶对病害发生有重要意义[45]，B.cinerea的主要生长方式是寄生，因此生成PG等酶和有机酸从而降解宿主细胞是它寄生的重要机制[46]。果胶降解被认为是其他细胞壁多聚物降解的前提[45]，在感染组织中，PG活性升高，纤维素酶活性未显著升高，但是果胶显著减少、纤维素降解，表明病原菌产生的酶降解了果胶多糖类物质。研究中经壳聚糖处理后，一方面宿主细胞壁果胶结合位点和纤维素的紧密规律排列受到保护，另一方面壳聚糖能使B.cinerea减少产生PG，从而阻止菌丝通过损伤宿主细胞而侵入果实体内，阻止了B.cinerea对果实的伤害。

4 结 语

综上所述，壳聚糖通过和病原菌-果实的相互作用来控制果实病害，在形态结构方面，主要表现在：1)壳聚糖具有直接抑菌作用，通过在病原菌胞内和胞外的共同作用，影响其细胞质膜完整性，细胞内物质发生改变，胞内物质渗漏，孢子、菌丝等形态发生变化，从而无法正常生长；2)壳聚糖通过诱导果实产生对病原菌的胞壁降解酶，使病原菌发生形变，无法继续侵入果实组织，最终被杀死；3)壳聚糖能诱导果实产生抗病性，除了诱导产生一些抗性物质以外，还能使果实产生结构抗性，即组织形态结构发生改变以抵御病原菌的入侵；4)病原通过分泌一些胞壁降解酶侵入果实细胞，壳聚糖能够抑制这些酶的产生，防止对果实细胞组织造成形态结构上的损害，从而保护果实组织不受病原菌的感染。在壳聚糖-果实-病原菌三者关系中，存在多层次的影响和作用，其中任何一个出现质和量的变化都可能引发整个作用机制的变化，而且由于其生理生化影响变化在先，结构变化在后，因此以形态结构水平研究为基础，深入开展生理生化及代谢途径变化等相关研究，说明引发结构变化的深层次原因，是今后研究的重点和关键。

壳聚糖对植物病原菌抑菌机理是十分复杂的，要经过一系列复杂的过程且抑菌程度有限。在实际生产应用中仅仅依靠壳聚糖类诱抗剂的作用并不能有效控制病害的发生。现阶段壳聚糖类物质与传统保鲜方法的复合使用是更为有效的方法。其中，壳聚糖和拮抗菌复合使用是当下生物防治领域研究的热点：El Ghaouth等[47]研究表明采后拮抗酵母Candida saitoana与壳聚糖衍生物联合处理能对苹果青霉病和灰霉病及柑橘绿霉病产生协同增效的控制效果。Sharma等[48]研究显示，酵母Candida utilis与壳聚糖配合使用对番茄果实病原菌Alternaria alternata和Geotrichum candidum的拮抗效力显著提高。

壳聚糖具有抗病谱广、持续时间较长、对环境无污染以及有效作用浓度低等特点，因而在果蔬病害控制方面具有良好的应用前景。由于基因工程技术、纯化和有机合成技术的发展，壳聚糖对果实-病原菌互作的影响及它在果实采后病害防治中的机理也将愈来愈清楚，壳聚糖等生物性杀菌剂在一定程度上替代化学农药将在农作物病害安全控制的领域中发挥重要作用。

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