磷脂在膜结构间的交换：温度和离子强度的影响*

蒋中英 张国梁马晶朱涛

1)(伊犁师范学院电子与信息工程学院，伊宁 835000)

2)(南京大学物理学院，南京 210093)

(2012年2月29日收到;2012年8月6日收到修改稿)

1 引言

生物界中存在着数千种天然磷脂.在不同生物膜中，各类磷脂组分比例的差异性直接与特异性生物膜功能相关.为建立并维持膜内磷脂组分比例，磷脂需要在不同的生物膜结构间实现跨膜运输与交换[1].因此，膜间磷脂交换是一项重要的生理活动.同时，药物输运也涉及磷脂跨膜交换问题.许多以脂质体为载体的药物正处于临床应用或审核阶段，这些药物的能效与磷脂跨膜交换存在关联.例如，在鼠类卵巢细胞的原位研究中，正电性磷脂包裹的多孔硅小球被报道具有较高的药物输送能力[2];在鼠、兔活体研究中，正电性磷脂载运的DNA，siRNA被证实具有显著的细胞转染表达效能[3]，而具有生物活性的细胞膜显负电性.因此，异电性磷脂膜间的接触和磷脂交换机理及其影响因素特别值得深入认知.

正、负电性磷脂膜间的平衡磷脂交换量与磷脂跨膜交换速率已经被深入研究.MacDonald等[4]，Saeki等[5]发现异电性膜组分分子间的静电吸引作用是磷脂跨膜交换的主要驱动力.带电磷脂组分比例越高，平衡磷脂交换量越大.文献[6—9］考察了磷脂跨膜交换速率的多种影响因素，膜间磷脂交换随着带电磷脂组分比例、囊泡浓度、磷脂疏水性、膜组分侧向扩散系数、膜曲率的提高而增快.这些研究为深入理解磷脂跨膜交换过程提供了参考.然而不同于平衡磷脂交换量与磷脂跨膜交换速率，交换过程中磷脂膜间接触状态(包括总磷脂膜接触面积等)的研究却仍处于起步阶段.通过冷冻电镜与浊度仪测试，Ichikawa等[5]，Lehn等[10]观测到伴随着磷脂跨膜交换的异电性囊泡聚集行为.但是由于悬浮囊泡表征手段的限制，实时、定量的囊泡聚集态研究仍是空白.界面膜体系(包括支撑膜、吸附囊泡等)具有便于表征的优点.平面表征手段如原子力显微镜(AFM)、表面等离子体共振(SPR)和石英电子微天平及耗散系数测量仪(QCM-D)等都能用于观测界面膜体系的动态变化过程.在先前的研究中，我们即采用吸附囊泡与支撑膜体系，实现了对磷脂跨膜交换过程中磷脂膜间接触状态的半定量表征，并初步探索了膜带电量、膜流动性、膜曲率与磷脂膜间最大总接触面积的关系[9].

在本研究中，我们进一步采用QCM-D研究了温度和离子强度对正电性支撑膜与负电性囊泡磷脂交换过程中膜间接触面积的影响.QCM-D是一种高精度、实时记录界面吸附层质量与黏弹性变化的表征技术，被广泛应用于测量高分子聚合物和蛋白质的动力学吸附过程.如Decher等[11]，Kasemo等[12]利用QCM-D研究了温度、盐浓度、pH值等对SiO2表面吸附囊泡向支撑膜转变的临界覆盖率的影响.在此，我们利用QCM-D手段表征了支撑膜表面异电性囊泡的吸附量，从而间接获取膜间接触状况的信息.研究表明：温度和盐浓度的提高降低最大膜间总接触面积.囊泡吸附速率和磷脂跨膜交换速率的变化在其中发挥着关键的调节作用.本研究有助于加深理解部分磷脂跨膜交换参与的生物学现象，并对脂质体药物载体的设计与应用提供参考.

2 实验部分

2.1 材料

二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)与二油酰基三甲氨基丙烷(DOTAP)购于 Avanti Polar Lipids公司.DOPC，DOTAP，DOPS分别为双电性、正电性与负电性磷脂(分子式如图1所示).所有磷脂跨膜交换实验都是在三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐-盐酸(Tris-HCl)缓冲液中进行的.缓冲液中Tris的浓度为100mmol/L，pH值为8，离子强度由NaCl浓度(CNaCl)调节.

图 1 DOPC，DOTAP和 DOPS的分子式 DOPC，DOTAP，DOPS分别为电双性、正电性与负电性磷脂

2.2 囊泡制备

囊泡通过挤出法制备[13]，其过程简述如下：氮气干燥磷脂氯仿溶液形成磷脂膜，进一步通过真空干燥箱干燥;缓冲液水化磷脂膜，形成多层脂质体;通过提取器(100 nm孔径滤膜)循环挤压脂质体溶液50次制备单层磷脂囊泡;制备的囊泡通过粒度仪(NanSight公司LM10纳米粒度分析仪)与冷冻电镜(FEI公司Tecnai 200 kV冷冻电镜)方法检测粒径，其流体力学半径(Rh)为56 nm±5 nm(图2).

图2 囊泡粒径的动态光散射和冷冻电镜测试，其中D为囊泡的流体力学直径，Cv是囊泡的浓度

2.3 石英电子微天平及耗散系数测量仪测试

QCM-D高精度地实时记录界面吸附层的质量与黏弹性变化信息，其测量参数包括共振频率偏移值(Δf)和能量耗散系数偏移值(ΔD).Δf与吸附层质量(Δm)近似符合Sauerbrey关系[14]：

其中CQCM是质量感应常数，ΔD与吸附层的黏弹性质相关.如果吸附物质的力学性质趋近于液体性质(高黏度、高耗散性，如磷脂囊泡)，则产生较高的ΔD(饱和吸附囊泡层的ΔD大于10-6);如果吸附物质的力学性质趋近于固体性质(高弹性模量、低耗散性，如磷脂支撑膜)，则产生较低的ΔD(饱和吸附磷脂支撑膜的ΔD约10-7)[12].

磷脂跨膜交换实验使用了SiO2涂层的石英芯片(基频为4.95 MHz)，在E1实验平台(瑞典QSense公司)上进行.溶液的进样流速被控制在20µL/min.具体步骤如下：首先在缓冲液环境下建立稳定的基线;然后通过囊泡融合在SiO2表面形成正电性磷脂支撑膜结构;舱室内剩余的囊泡通过缓冲液漂洗除去;进一步通入负电性磷脂囊泡，磷脂在负电性囊泡与正电性支撑膜间进行跨膜交换;磷脂交换结束后，再次通入缓冲液;每个交换实验重复3次得到平均值与标准方差.文中所有数据的谐频数为7.

3 结果

负电性囊泡与正电性支撑膜间的磷脂跨膜交换实验通过QCM-D表征.图3和图4展示了不同温度、离子强度条件下测得的Δf-t与ΔD-t曲线.所有曲线以t=35 min为界可分为两个部分：前半部分时间对应着正电性囊泡在SiO2表面融合形成支撑膜结构(成膜过程);后半部分时间对应着负电性囊泡与正电性支撑膜进行磷脂跨膜交换(交换过程).

3.1 成膜过程

对于DOTAP/DOPC组分比例为20/80的正电性囊泡的成膜过程，首先-Δf与ΔD随时间增大，表示囊泡逐渐吸附到SiO2表面.随后-Δf与ΔD降低，表示在达到囊泡临界表面覆盖率后，吸附囊泡开始显著破裂形成片层支撑膜结构.最后Δf稳定在-24.2 Hz±0.5 Hz，ΔD平衡在(5.0±1.2)×10-7，说明形成了完整的支撑膜结构.对于DOTAP/DOPC组分比例为50/50的正电性囊泡的成膜过程，-Δf与ΔD单调增加并最终平衡在-22.0 Hz±0.7 Hz与(6.4±3.4)×10-7，同样表明形成了完整的支撑膜结构.以上两种组分磷脂囊泡的成膜过程分别对应着两条成膜路径：前者，囊泡所带正电量较低(0.09 C/m2)，与SiO2衬底(负电性)吸引作用较弱，需要借助吸附囊泡之间的压力(即通过达到囊泡临界表面覆盖率)实现成膜;后者，囊泡所带正电量较高(0.23 C/m2)，与SiO2衬底吸引作用较强，在底面吸附后直接破裂成膜.Brisson等[15]通过AFM与椭圆偏振光谱测试也观察到了这种衬底-囊泡相互作用强弱引起的不同的囊泡成膜途径.

3.2 交换过程

在不同温度条件下，交换过程测得的Δf与ΔD随t的变化趋势符合相同的规律(图3).首先-Δf与ΔD随时间升高，表示负电性囊泡开始吸附到正电性支撑膜表面(吸附主导阶段).随后-Δf与ΔD达到极值-Δfmin与ΔDmax.其中-Δfmin对应着交换过程中支撑膜表面的最大囊泡吸附量[9].之后-Δf与ΔD开始降低，表示随着磷脂跨膜交换，囊泡与支撑膜间的静电吸引作用逐渐丧失，囊泡在支撑膜表面的解吸附主导了衬底的质量与黏弹性变化(解吸附主导阶段).最后Δf与ΔD分别稳定在-23.5 Hz±2.1 Hz与 (1.2±0.6)×10-6，缓冲液漂洗不会显著改变平衡的Δf与ΔD值，说明大多数吸附囊泡实现了解吸附[16].这个磷脂跨膜交换过程在Kasemo与我们之前的研究中已被详细阐述[9].从Δf开始下降到最终Δf恢复平衡之间的时间被定义为tint.它表示囊泡与异电性支撑膜的总接触作用时间.在时间tint内，磷脂在囊泡与支撑膜间进行跨膜交换.如果平衡磷脂交换量确定，则tint越大，磷脂跨膜交换速率越低;反之亦然.由图3可见，tint随着温度的升高而降低.温度每升高10°C，tint下降14%—38%.由于温度变化不会显著改变磷脂跨膜交换的静电作用驱动力和平衡磷脂交换量[4]，所以温度的升高加速了磷脂跨膜交换过程.同时，由图3可见，Δfmin随着温度的升高而降低.温度每升高10°C，-Δfmin降低24%—60%.

在不同离子强度条件下，交换过程测得的Δf与ΔD随t的变化趋势具有显著差别(图4).当氯化钠浓度(CNaCl)为400 mmol(离子强度约为 0.4mol/L)，支撑膜 DOTAP/DOPC组分比为20/80，囊泡内DOPS/DOPC组分比任意时，Δf随着时间无显著变化，表示支撑膜表面无囊泡吸附;当CNaCl为400 mmol，支撑膜DOTAP/DOPC组分比为50/50，囊泡内DOPS/DOPC组分比为20/80时，Δf随着t单调减小并最终稳定在-8.3 Hz±1.5 Hz，ΔD单调增加并最终平衡在(3.6±0.4)×10-6，表示囊泡不可逆吸附在支撑膜表面.出现以上两种情况的原因可能是溶液中的离子屏蔽了囊泡与支撑膜间的静电吸引作用，导致囊泡无法在支撑膜表面吸附或吸附后没有进行有效的磷脂跨膜交换(致使囊泡无法进一步解吸附).对于CNaCl为400 mmol，支撑膜DOTAP/DOPC组分比50/50，囊泡DOPS/DOPC组分比50/50和其他盐浓度(CNaCl为0 mmol或100 mmol，离子强度分别约为10-8mol/L和0.1 mol/L)条件下的实验，-Δf与ΔD随时间先增加后减小，表示经历了囊泡吸附主导与解吸附主导的磷脂交换的两个阶段.同时，tint随着盐浓度的提高而延长，CNaCl提高 100 mmol，tint增加 21%—148%.因为盐浓度升高屏蔽了磷脂跨膜交换的静电作用驱动力，降低平衡磷脂交换量[4]，所以离子强度的提高降低了磷脂跨膜交换速率.由图4中还可以得到，-Δfmin随着离子强度的提高而降低，CNaCl提高100 mmol，Δfmin降低6%—39%.

图3 温度对磷脂跨膜交换的影响 (a)，(b)Δf-t与ΔD-t曲线;(c)，(d)在不同温度条件下测得的tint与-Δfmin统计数据直方图;实验所处温度被标注在各图中，该组实验Tris-HCl缓冲液中CNaCl为100 mmol

4 讨论

单个囊泡和支撑膜之间的接触面积与囊泡在支撑膜表面吸附产生的形变(囊泡的高宽比变化)直接相关.QCM-D的-ΔD/Δf(表示单位质量吸附层所对应的黏弹性)被证实能够用于表征吸附囊泡的形变情况[12].囊泡形变程度越高(高宽比越低于1)，产生的-ΔD/Δf越低.不同溶液环境条件下交换过程的ΔD-Δf曲线需仔细地分析.如图5所示，对于能够有效进行磷脂跨膜交换的实验，ΔD-Δf曲线构成一个环路，曲线的下半段对应着囊泡吸附主导的阶段，上半段对应着囊泡解吸附主导的阶段.吸附主导阶段的-ΔD/Δf值一般略小于解吸附主导阶段的-ΔD/Δf值，表明随着磷脂跨膜交换的进行，囊泡与支撑膜间的静电吸引作用逐渐减弱，吸附囊泡的形变程度略微降低.以时间轴统计-ΔD/Δf值，发现单条实验曲线的-ΔD/Δf标准方差与平均值之比都低于12%，说明在整个交换时间段中，吸附囊泡的形变差异性并不非常显著.统计所有实验曲线的平均-ΔD/Δf值得-ΔD/Δf=0.36±0.03，说明不同溶液环境带来的吸附囊泡形变差异性也较小.因此，在以下的囊泡-支撑膜总接触面积研究中，单个囊泡与支撑膜的接触面积被近似为相同.

由于单个吸附囊泡与支撑膜的接触面积相对恒定，所以囊泡与支撑膜的总接触面积直接取决于囊泡的吸附量，即QCM-D实验参数Δfmin在代表支撑膜表面囊泡吸附最大量的同时，也对应着最大的囊泡-支撑膜总接触面积.我们之前的研究发现，囊泡在异电性支撑膜表面的最大吸附量是由囊泡吸附速率和磷脂跨膜交速率之间的竞争决定的[9].囊泡吸附速率的提高有利于增加最大囊泡吸附量，而磷脂跨膜交换速率的提高加速了囊泡与支撑膜间静电吸引作用的丧失和囊泡的解吸附过程，不利于增加最大囊泡吸附量.

图3中的QCM-D数据显示，Δfmin随着温度的升高而降低，表示交换过程中囊泡的最大吸附量和最大囊泡-支撑膜总接触面积随着温度的升高而降低;同时，tint随着温度的升高而降低，即磷脂跨膜交换速率随着温度的升高而增加.基于囊泡吸附速率和磷脂跨膜交换速率对于最大囊泡吸附量的竞争效应，温度的提高对磷脂跨膜交换的加速效应应强于对囊泡吸附的加速效应.这可以通过以下的分析简单地理解.一方面，由于囊泡的吸附过程是受囊泡扩散速率限制的[17]，所以温度的升高会增加囊泡的扩散和吸附速率.根据Stokes-Einstein方程[9]：

其中D是囊泡扩散速率，kB是波尔兹曼常数，T是绝对温度，η是溶液黏度.因此，实验温度提升10—20°C，囊泡扩散与吸附速率增加3%—6%.另一方面，半融合结构是磷脂在异电性磷脂膜间交换所依赖的中间态结构(如图6所示)[18].在半融合结构中，磷脂通过侧向扩散实现跨膜交换[18].温度的提高显著增加磷脂的侧向扩散速率.Papahadjopoulos等[19]研究表明，温度从20°C提升到40°C，液晶相磷脂膜的侧向扩散速率提升一个量级.随着磷脂侧向扩散速率的增大，磷脂跨膜交换速率也被显著提高.因此，温度的升高增加囊泡吸附速率和磷脂跨膜交换速率，但对后者的增强效应强于前者，导致最大囊泡吸附量和最大囊泡-支撑膜总接触面积降低.

图4 离子强度对磷脂跨膜交换的影响 (a)，(b)Δf-t与ΔD-t曲线;(c)，(d)在不同盐浓度(离子强度)条件下测得的tint与-Δfmin统计数据直方图;实验所用CNaCl被标注在各图中，该组实验的实验温度为25°C

图5 交换过程的囊泡在异电性支撑膜表面吸附产生的ΔD-Δf曲线(交换过程前的ΔD，Δf值被归零) (a)，(b)的数据分别取自图3和图4;吸附、解吸附主导阶段对应曲线示意图标明在图中的左下角

图6 交换过程中半融合结构示意图 两磷脂膜中相邻两叶发生融合，较远侧两叶保持完整，在半融合结构中，磷脂通过侧向扩散实现跨膜交换

图4中的QCM-D数据显示，Δfmin随着离子强度的升高而降低，表示交换过程中囊泡的最大吸附量和最大囊泡-支撑膜总接触面积随着离子强度的增大而降低;同时，tint随着离子强度的升高而增大，即磷脂跨膜交换速率随着离子强度的升高而降低.基于囊泡吸附速率和磷脂跨膜交换速率对于最大囊泡吸附量的竞争效应，离子强度的提高对磷脂跨膜交换的减速效应应弱于对囊泡吸附的减速效应.这也可以通过以下的分析简单的理解：一方面，囊泡与支撑膜间的静电吸引作用是囊泡向支撑膜靠近的主要驱动力，而长程的静电相互作用被离子以双电层形式强烈屏蔽，CNaCl为0，100，400 mmol缓冲溶液的Deybe半径 (电场屏蔽尺度)分别为 3.1µm，1 nm，0.5 nm，因此，离子强度的增加显著降低囊泡的吸附速率;另一方面，盐离子破坏磷脂膜表面的有序水化层结构，促进短程的磷脂膜间接触[8,20]，有利于加速实现磷脂的跨膜交换，缓解长程静电相互作用减弱带来的磷脂跨膜交换速率降低.因此，离子强度的升高降低了囊泡吸附速率和磷脂跨膜交换速率，但对于前者的减弱效应强于后者，导致最大囊泡吸附量和最大囊泡-支撑膜总接触面积降低.

5 结论

磷脂在异电性膜结构间的交换是一个复杂的过程.本文采用界面膜体系通过QCM-D表征手段研究了温度和离子强度对该过程的影响.研究表明：1)温度的升高加速囊泡与支撑膜间磷脂跨膜交换过程，降低囊泡的最大吸附量;离子强度的升高减缓囊泡与支撑膜间磷脂跨膜交换过程，降低囊泡最大吸附量;2)在各溶液条件下，支撑膜表面吸附囊泡形变的差异性较低，因此囊泡的吸附量直接对应着囊泡与支撑膜的总接触面积;3)温度升高对磷脂跨膜交换的加速效应强于对囊泡吸附的加速效应，造成囊泡-支撑膜最大总接触面积随温度升高而降低;离子强度升高对磷脂跨膜交换的减速效应弱于对囊泡吸附的减速效应，造成囊泡-支撑膜最大总接触面积随离子强度升高而降低.

许多磷脂跨膜交换过程的问题仍待解决，如膜间接触面积的动力学变化过程、磷脂包裹颗粒与囊泡的交换差异性[21]、磷脂囊泡脱离支撑膜表面的方式[22]等.实际的医药学领域应用还要涉及囊泡在支撑膜表面的破裂和内含物释放问题[23].进一步探索膜结构间的接触信息将有助于加深我们对以上问题的理解.

[1］Holthuis J C M，Levine T P 2005Nat.Rev.Mol.Cell Biol.6 209

[2］Liu J，Jiang X，Ashley C，Brinker C J 2009JACS131 7567

[3］Zuhorn I S，Engberts J B F N，Hoekstra D 2007Eur.Biophys.J.36 349

[4］ Pantazatos D P，Pantazatos S P，MacDonald R C 2003J.Membr.Biol.194 129

[5］Saeki D，Sugiura S，Baba T，Kanamori T，Sato S，Mukataka S，Ichikawa S 2008J.Colloid Interface Sci.320 611

[6］Reinl H M，Bayerl T M 1994Biochemistry33 14091

[7］Jones J D，Thompson T E 1989Biochemistry28 129

[8］Stamatatos L，Leventis R，Zuckermann M J，Silvius J R 1988Biochemistry27 3917

[9］Zhu T，Jiang Z，Ma Y 2012Colloids Surf.B 97 155

[10］MarchiArtzner V，Jullien L，Belloni L，Raison D，Lacombe L，Lehn J M 1996J.Phys.Chem.100 13844

[11］Seantier B，Breffa C，Felix O，Decher G 2005J.Phys.Chem.B 109 21755

[12］Reimhult E，Hook F，Kasemo B 2003Langmuir19 1681

[13］Zhu T，Xu F，Yuan B，Ren C，Jiang Z，Ma Y 2012Colloids Surf.B 89 228

[14］Sauerbrey G 1959Z.Angew.Phys.155 206

[15］Richter R P，Brisson A R 2005Biophys.J.88 3422

[16］Wikstrom A，Svedhem S，Sivignon M，Kasemo B 2008J.Phys.Chem.B 112 14069

[17］Keller C A，Glasmastar K，Zhdanov V P，Kasemo B 2000Phys.Rev.Lett.84 5443

[18］Lei G H，MacDonald R C 2003Biophys.J.85 1585

[19］Wu E S，Jacobson K，Papahadjopoulos D 1977Biochemistry16 3936

[20］Sapuri A R，Baksh M M，Groves J T 2003Langmuir19 1606

[21］Ding H M，Tian W D，Ma Y Q 2012ACS Nano6 1230

[22］Li J B，Zhang Y，Yan L L 2001Angew.Chem.Int.Edit.40 891

[23］An Z H，Tao C，Lu G，Mohwald H，Zheng S P，Cui Y，Li J B 2005Chem.Mater.17 2514?