孕中晚期胎儿细胞遗传学的诊断分析

黄曙方，李 萍，丁 红，刘 珍，肖定璋，陈 景，陈少贤，孟锦绣，余细勇

由于目前遗传病尚无有效的治疗方法，在出生前对胎儿进行检查，降低遗传病的发生对家庭、社会造成的危害显得尤为重要。随着产前诊断的广泛开展，预防了大量的严重先天性出生缺陷儿的出生。细胞遗传学诊断是应用最广泛且非常准确的产前诊断方法，最常用的为羊水及脐血染色体的产前诊断。现对2003年6月—2011年12月进行细胞遗传学产前诊断的1 945例病例进行分析，探讨染色体异常与年龄、孕周、手术指征、手术方式、胎儿结局等临床特点的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择在我院接受产前诊断有指征的孕妇1 956例，孕妇年龄20～45岁，孕周为16～39周，其中16～23+6周者1 270例，24周及以上者686例。经知情同意签字后行羊膜腔穿刺或脐血管穿刺。

1.2 方法

1.2.1 羊水培养及染色体分析的方法 16～23+6周者行羊水穿刺，24周及以上者行脐血管穿刺。在无菌条件下B超定位后行羊膜腔穿刺术，开始1 ml羊水弃去，再抽取羊水20～25 ml分装3支Falcon无菌离心管中1 800 r/min离心10 min，弃上清，每管留细胞沉淀及羊水0.5～1.0 ml，置于4 ml羊水完全培养基(GIBCO的A mino MAXTM-Ⅱ Complete，或以色列的BIO-AMF-2)，37 ℃ 5%CO2培养箱中静止培养5～7 d后，在倒置显微镜下观察，出现散在梭状细胞贴壁生长，则换液。以后每天观察，当有3个以上较大克隆(5倍镜下克隆占满整个视野)且克隆中有较多透亮的圆形细胞时即可收获。在收获前3～4 h加入秋水仙素，用0.5% trypsin-EDTA消化3 min左右，专用刮刀刮下细胞，2 000 r/min离心，弃上清，0.075 mol/L氯化钠低渗15 min，用3∶1甲醇∶冰醋酸预固定和固定后，滴片，常规G显带。每例标本按照ISCN(1995)标准，油镜下数20～30个中期分裂象，发现异常或嵌合体翻倍，必要时脐血染色体再次确认，分析5个核型。

1.2.2 脐血培养及染色体分析方法 在超声引导下行脐血管穿刺术，取脐血2 ml，置于肝素钠抗凝的一次性取血管中，取0.5 ml接种于“益生菌”细胞培养液(5 ml)，每例接种2瓶，37 ℃培养72 h后加入秋水仙素，2 h后收获，收获、制备染色体标本、分析、计数同羊水。

2 结果

2.1 手术指征 孕中晚期胎儿染色体检查总病例为1 956例，手术指征分为6大类(6类指征的病例之间无交叉)：(1)高龄，927例，占47.4%，其中染色体异常24例(如同时高龄且血清学异常，取高龄作为首要指征)。(2)血清学筛查异常，564例，占28.8%，其中染色体异常13例。(3)B超异常，331例，占16.9%，其中染色体异常30例。(4)不良生育史，74例，占3.8%(多数不良生育史有高龄，均归为高龄指征内)。(5)父母一方为染色体异常携带者，10例，占0.5%，其中染色体异常5例。(6)其他原因50例，占2.6%。

2.2 细胞培养结果 羊水培养成功1 267例，培养成功率99.8%；脐血培养成功678例，培养成功98.8%，共1 945例。细胞培养失败例数11例，占总例数0.6%，具体情况见表1。

2.3 染色体核型分析 发现胎儿异常核型74例，其中羊水34例，脐血40例，具体情况见表2、3。其中21三体29例(占异常核型74例的39.2%)(包含3例嵌合体)；13三体4例(5.4%)；18三体11例(14.9%)；45，X 5例(6.8%)；47，XXX 3例(4.1%)；47，XYY 3例(5.4%)(其中有1例嵌合体)；含有标志染色体mar的嵌合染色体2例(2.7%)(1例46，XX，嵌合的mar证实为部分18号染色体；另1例45，X，嵌合的mar证实为部分Y染色体)；其他异常染色体18例(24.3%)。非整倍体染色体(数目异常)共56例，占异常染色体的75.7%。

表1 11例细胞培养失败病例的具体情况

表2 34例羊水异常染色体核型患者的具体情况

表3 40例脐血异常染色体核型患者的具体情况

发现胎儿染色体异态性101例(占培养成功1 945例的5.2%)。其中46，XN，inv(9)27例(占异态总例数101例的26.7%)；46，XY，Yqh+ 31例(30.7%)；46，XY，Yqh- 1例(1.0%)；其他次缢痕及随体异态42例(41.6%)。

2.4 染色体异常的妊娠结局 本研究中发现胎儿异常核型74例(占培养成功1 945例的3.8%)。因染色体异常终止妊娠58例，占异常染色体的78.4%。广东省人民医院自2003年后恢复开展介入性产前诊断，至2011年，共穿刺1 956例。其中穿刺术后早产1例，胎死宫内1例，手术相关妊娠丢失率为0.1%。

3 讨论

本研究在发现的胎儿异常染色体中，由羊水检出的共34例，占羊水的2.7%；脐血检出异常40例，占脐血检查的5.9%。脐血的染色体异常率高于羊水，推测可能与手术指征有关。由表格可看出抽取羊水检查的手术指征多为高龄、唐氏筛查高风险，而抽取脐血检查的手术指征以B超异常为主。越来越多研究表明，超声在染色体异常的检出中起着非常重要的作用。国外有研究发现48%产前超声异常胎儿通过产前诊断证实存在染色体异常[1]。国内有研究甚至发现因超声胎儿结构异常而行胎儿染色体检查的染色体异常率最高，高达50%[2]。在本研究中共有56例数目异常，因B超异常而行染色体的共计26例，其中21三体(包括嵌合)8例，占该病例的27.6%(74例染色体异常中21三体共29例，其中8例是B超发现的异常而行产前诊断)；13三体3例，占该病例的75%(74例中13三体共有4例，有三例是B超发现的)；18三体(包括嵌合)7例，占该病例的63.6%(74例中11例18三体，由B超发现的有7例)；特纳氏综合征(包括嵌合)4例，占该病例的100%(74例中45，X有 4例均由B超发现)；47，XXY 1例，占该病例的33.3%(74例中47，XXY有3例，1例由B超发现)；47，XYY 1例，占该病例的33.3%(74例中47，XYY有3例，1例由B超发现)；嵌合mar 2例，占该病例的100%(2例均由B超发现而行产前诊断)。由此可见，超声在胎儿非整倍体的检出中非常敏感，国外也多有研究，对非整倍体染色体病超声诊断也形成一致的诊断标准[3]。在18三体、13三体及性染色体数目异常中尤其表现出突出的作用。而在21三体的检出中占的比例相对较低，可能原因是在因高龄、唐氏筛查高风险已检出大部分，且该病特征是以智力低下为主，外观的异常及脏器畸形并不太突出，非常有经验的B超医生才能发现软指标异常，提示须行胎儿染色体检查。对于在24周前已有指征(如高龄、唐氏筛查高风险)而不愿意做产前诊断的孕妇，在孕中后期详细的B超检查起到了很好的把关作用，减少了许多的出生缺陷儿的出生。

在我院产前诊断的细胞培养成功率是较高的。其中羊水培养成功率99.8%；脐血培养成功率98.8%。均超过卫生部及卫生厅的要求，也高于国内的一般水平[4-5]。对此笔者也有些心得。在培养羊水的过程中，换液时将弃液继续留下培养，如果第一批细胞最后制片后可分析的分裂相少，则弃液可种下1周左右换液，换液2 d后再次收获，还有机会得到理想的效果，成功发出报告。因此本研究的羊水培养成功率是较高的。脐血培养失败8例，有5例是胎儿水肿，推测可能因为水肿导致培养的条件的改变而培养失败。

本研究中胎儿染色体异常率为3.8%，与文献报道接近[6-7]。高于新生儿染色体异常率7‰[8]。可能原因为需介入性产前诊断的孕妇均有高危因素，且有染色体异常儿，在孕期可能会出现流产、早产、死产、胎死宫内、引产等情况，使得胎儿染色体异常的检出率高于新生儿。

本研究中共有14例平衡易位的胎儿(0.71%)，略高于台湾学者的一项研究报道(0.53%)[9]。除1例有严重的唇腭裂引产外，其余分娩，追踪结局新生儿外观均正常。在这14例平衡易位胎儿，有5例因为双亲一方有平衡易位而手术。另外9例因高龄、唐氏筛查高风险、B超异常而行介入性产前诊断手术，追踪家系有2例与父母无关，余7例均遗传自父母。在此1 956例中，有10例因双亲之一染色体异常手术，胎儿染色体异常5例，染色体异常率在各手术指征中最高，为50%，与文献报导相似。因此在夫妇多次自然流产后需行染色体检查，及时发现异常，在孕中期必须行产前诊断[10]，如与亲代染色体核型一致，致畸的风险较低[11]，可继续妊娠。如平衡易位为新发，则B超监测显得尤为重要。因为在易位过程中，可能会有一些微小的遗传物质的缺失和重排，而常规G显带染色体检查不能发现，但B超可观察到胎儿畸形。值得注意的是除了发现染色体数目异常外，在发现其他染色体异常(如异态性、平衡易位等)时，首先并不是急于建议引产，而应行父母双方的染色体检查，结合B超检查才给孕妇指导意见。

近十年广东省人民医院进行有针对性的胎儿染色体检测，极大地减少了出生缺陷儿的出生，对避免许多家庭悲剧，减轻社会负担做出不小的贡献。但是在工作中也发现，介入性产前诊断在社会中的宣传普及也有很多不够之处，许多孕妇及其家人对产前诊断的认识不足或片面，只着重于手术的风险而对染色体病的危害视而不见；而许多临床医生对产前诊断手术指征的把握尚不清晰。在全社会宣传产前诊断是优生优育的重要手段，使产前诊断的必要性深入民心，仍需医务工作人员乃至全社会共同努力。

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