原创中药新药红珠胶囊质量标准的研究*

彭 维，苏薇薇，古淑仪，王永刚，郭 静

(1.中山大学广州现代中药质量研究开发中心，广东 广州 510275；2. 广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303)

红珠胶囊是中山大学研制的原创中药五类新药，具有止咳、化痰的功效，用于呼吸道疾病引起的咳嗽，痰多。药理研究表明：总黄酮类化合物是化橘红发挥药效的主要物质基础[1-2]，其中柚皮苷为其主要的活性成分，占有效部位的70%以上。为保证产品质量，确保临床疗效，本研究建立了制剂中柚皮苷、野漆树苷的薄层色谱鉴别，并采用紫外分光光度法测定红珠胶囊中总黄酮含量并进行溶出度考察，采用高效液相色谱法测定其中柚皮苷含量。

1 仪器与材料

Dionex P680型高效液相色谱仪(美国戴安公司，四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、PDA-100检测器及Chromeleon工作站)； BP211D电子分析天平(瑞士沙多利斯公司)；ATS4薄层自动点样仪，REPROSTAR 3薄层成像系统，TLC PLATE HEATERⅢ薄层板加热器(瑞士CAMAG公司)；TU-1901紫外-可见光分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；ZRS-8G智能溶出试验仪(天津大学无线电厂)；T660/H超声波清洗器(美国埃玛公司)。

化橘红对照药材(中国药品生物制品检定所提供，批号1165-200001)；柚皮苷(供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供，批号110722-200309)；野漆树苷(美国Sigma公司提供，纯度>95%，批号A8906)。6批红珠胶囊由中山大学广州现代中药质量研究开发中心研制，委托广东环球制药有限公司生产。

甲醇(德国默克)为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

取本品内容物研磨均匀，取约0.2 g，加甲醇10 mL，超声处理(功率360 W，频率35 kHz)10 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取化橘红对照药材粉末1 g，加甲醇10 mL，超声处理(功率360 W，频率35 kHz)10 min，滤过，作为对照药材溶液。吸取上述对照品溶液3 μL，对照药材溶液、供试品溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮-乙酸乙酯-水-冰醋酸(20∶40∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，60 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，结果见图1。

图1 化橘红对照药材(1)、对照品(2)、阴性对照(3)、红珠胶囊供试品(4-6)薄层色谱图Fig.1 TLC of Citrus grandi reference drug(1)，CRS(2) negative control(3) and Hongzhu Capsule(4-6)

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取已干燥至恒质量的柚皮苷对照品15.00 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每 1 mL中含柚皮苷300 μg的对照品溶液Ⅰ；精密量取对照品溶液Ⅰ5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL中含柚皮苷15 μg的对照品溶液Ⅱ。

2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的胶囊内容物，研细，取0.1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇约70 mL，超声处理(功率360 W，频率35 kHz)30 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液Ⅰ， 精密量取供试品溶液Ⅰ1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液Ⅱ。

2.2.3 专属性试验 分别取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，以甲醇作为溶剂空白，分别进行光谱扫描(400～200 nm)，结果表明：对照品溶液和供试品溶液的光谱图基本一致，最大吸收波长均在(283±1) nm，阴性对照溶液在283 nm处无干扰。故测定波长选择283 nm。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液Ⅰ：0.00(空白)、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成对照品系列溶液。以甲醇作为空白，在波长283 nm测定吸收值。以质量浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：A= 0.037 0C+0.012 6 (r=0.999 8)。柚皮苷质量浓度在0～27 μg /mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取对照品溶液Ⅱ，连续测定6次，计算柚皮苷吸光度的RSD为0.41%，表明方法精密度好。

2.2.6 稳定性试验 取供试品溶液Ⅱ，分别于0、10、30、60、90、120 min测定，RSD为1.26%，表明供试品溶液在2 h内稳定性好。

2.2.7 重复性试验 取同一批号(20050102) 的红珠胶囊内容物粉末(以平均装量0.120 10 g计)，研细，平行取样6份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液6份，测定总黄酮的含量及计算RSD为2.45%，表明方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验 按照高、中、低3个质量浓度梯度，精密称取已测知含量的红珠胶囊(20050102，平均含量46.20 mg/粒，折算质量分数为38.47%)样品9份，每个质量浓度梯度平行操作3份，再分别精密加入一定量的柚皮苷，依法测定，计算回收率，平均加样回收率为99.63%(n=9)，RSD为1.95%。表明方法回收率好。

2.2.9 样品测定 取上述对照品溶液Ⅱ及供试品溶液Ⅱ，在283 nm的波长处测定吸光度，计算，即得。

表1 红珠胶囊总黄酮含量测定结果

本品每粒含总黄酮以柚皮苷(C27H32O14)计，不得少于38 mg，不得高于56 mg。

2.2.10 溶出度测定[3]取本品，每批随机取6粒，照溶出度测定法(《中国药典》2010年版二部附录X C第一法)，以水900 mL为溶出介质，转速为100 r/min，依法操作，经45 min，取溶液5 mL，滤过，精密量取续滤液2.5 mL，置5 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，按照上述总黄酮紫外分光光度法，在283 nm的波长处分别测定吸光度；另取柚皮苷对照品适量，精密称定，加溶出介质溶解并定量稀释制成每1 mL中约含16 μg的溶液，同法测定，计算每粒的溶出量及以实际含量计的溶出度，并作均一性比较。限度为实际含量的70%，应符合规定。结果见表2。

表2 红珠胶囊溶出度测定结果

2.3 柚皮苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 Dikma Diamasil C18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流动相：甲醇-醋酸-水(35∶4∶61)；检测波长为283 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量5 μL。

2.3.2 专属性试验 分别量取对照品溶液Ⅰ、供试品溶液Ⅰ注入液相色谱仪，记录色谱图，结果柚皮苷能与样品中其他成分峰分离良好。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于2 000，柚皮苷与邻近色谱峰达到基线分离，分离度大于1.5。色谱图见图 2。

图 2 柚皮苷对照品(A)和供试品(B)色谱图Fig.2 HPLC of naringin CRS(A) and Hongzhu Capsule(B)

2.3.3 线性关系考察 精密称取柚皮苷对照品0.010 06 g，用甲醇定容到50 mL量瓶中，再精密吸取5 mL稀释至10 mL，质量浓度为0.100 6 mg/mL。按上述色谱条件，吸取柚皮苷对照品，以2、5、10、15、20 μL连续进样，测定。以峰面积积分值A对对照品的进样量C(μg)进行回归分析，得回归方程：柚皮苷A=27.907C-0.096 1，r=1.000 0。结果表明柚皮苷在0.201 2～2.012 0 μg范围线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 精密吸取柚皮苷对照品溶液10 μL，在以上色谱条件下，连续重复进样5次，依法测定，计算柚皮苷峰面积的RSD为1.03%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 取供试品溶液，室温下分别放置0、2、4、8、12、24、48 h后，按“2.3.1”项色谱条件，取5 μL进样，依法操作，测定峰面积，计算柚皮苷峰面积的RSD为2.14%，表明稳定性较好。

2.3.6 重复性试验 取同一批号的同一批号红珠胶囊内容物(批号20041222，平均装量0.121 11 g) 6份，精密称定，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项色谱条件，进样5 μL，测定柚皮苷的含量及计算RSD为1.95%，表明方法重复性较好。

2.3.7 加样回收率试验 精密称取已测知柚皮苷含量的红珠胶囊内容物(批号20041222，柚皮苷质量分数36.67%，44.42 mg/粒)适量，再分别精密加入一定量的对照品，使供试品溶液中的柚皮苷质量浓度分别在柚皮苷标准曲线的高、中、低区域各3份，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项色谱条件，进样5 μL，测定，计算，平均加样回收率为97.92%，RSD为2.80%，表明方法回收率好。

2.3.8 样品测定 取装量差异项下的胶囊内容物, 研细，精密称定，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取柚皮苷对照品、供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标法计算样品中柚皮苷的含量，结果见表3。

表3 红珠胶囊中柚皮苷的含量测定结果

3 讨 论

1)建立与国际接轨的中药质量控制方法，是中药现代化的客观要求[4-5]。红珠胶囊的化学成分组成是以柚皮素为母核的柚皮苷、新北美圣草苷等二氢黄酮类化合物以及柚皮苷的氧化物野漆树苷，最大吸收波长大多在(283±1) nm处，且柚皮苷含量占有效部位的70%以上，故可采用紫外分光光度法测定总黄酮含量。所建立的总黄酮含量测定方法可用于胶囊溶出度的测定。

2)本研究建立的质量标准，方法简便、准确，重复性好，为全面监控红珠胶囊的质量提供了可靠的方法。

参考文献：

[1] 李沛波，马燕，王永刚，等. 化州柚提取物止咳化痰平喘作用的实验研究[J]. 中国中药杂志，2006，31(16):1350-1352.

[2] 李沛波，苏畅，毕福钧，等. 化州柚提取物止咳作用及其机制的研究[J].中草药，2008，39(2):247-250.

[3] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典 (一部、二部)[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：69, 附录85.

[4] 关倩怡，黄琳，彭维，等. 口炎清颗粒指纹图谱研究[J].中山大学学报:自然科学版，2011，50(1):115-118.

[5] 彭维，黄琳，关倩怡，等. 红腺忍冬的质量研究[J].中山大学学报:自然科学版，2010，49(6):142-144.