结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用价值

王立红 付秀华 张桂芝 李国华 顾岩 高俊珍

据WHO估计, 2011年全球约有870万例新发结核病患者,140万例死于结核病[1]。结核病已成为全球所有传染性疾病中成年人的首要死因。2004年WHO报告显示，结核病诊断率仅为37%, 即使在发达国家也仅有50%的结核病患者通过细菌学方法被证实[2]。因此，寻求一个敏感度及特异度均较高的检测方法已成为临床的迫切需求。大量研究表明，结核特异抗原诱导活化分泌γ干扰素的T 淋巴细胞可作为结核分枝杆菌感染的一种可靠标志物。酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)(T-SPOT.TB)被认为是目前检测T淋巴细胞反应最灵敏的方法，而且可以应用于疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等多个方面[3]。目前，国内外多数研究缺乏大样本的统计数据，我院自2011年7月至2012年4月应用此项技术共检测1042例患者，本研究总结分析了其中有较完整资料的587例住院患者的检测结果,以评价T-SPOT.TB技术在结核病诊断及鉴别结核是否活动方面的应用价值。

对象和方法

一、研究对象和试剂来源

1.研究对象：收集2011年7月至2012年4月我院行T-SPOT.TB检测的587例住院患者，患者来源于风湿科、呼吸科、消化科、胸外科及内分泌等多个科室，男232例，女355例，年龄13～88岁，平均年龄(53.30±16.11)岁。按照患者各自最后确诊情况，分为结核性疾病组(亚组分为活动性结核与陈旧性结核；肺结核与肺外结核)和非结核性疾病组(亚组分为免疫损害组和非免疫损害组)，收集患者的年龄、性别、病程、临床表现、T-SPOT.TB、病理、PPD、抗酸杆菌涂片及结核抗体(Mtb-Ab)等结果。

结核性疾病组128例，其中活动性结核组103例的具体情况见表1，陈旧性结核组25例(肺结核18例，结核性胸膜炎6例，肾结核1例)；非结核性疾病组459例，其中免疫损害者[4]241例，非免疫损害者218例。

活动性结核性胸膜炎诊断标准：①有低热、盗汗、乏力等结核中毒症状；②超声检查提示有胸腔积液，肺部CT检查提示伴或不伴结核病灶；③胸腔积液化验为以单核细胞为主的渗出液，用酶法检测腺苷脱氨酶(ADA)>45 U/L；④胸腔积液查癌细胞为阴性，癌胚抗原正常；⑤抗结核治疗胸腔积液吸收明显；⑥胸膜活检有典型结核病变(如结核性肉芽肿或干酪样病变)，或痰抗酸杆菌涂片阳性；符合①～⑤或⑥，并且抗结核治疗至少2周，活动性结核性腹膜炎及心包炎的诊断标准与之相同。

活动性肺结核患者的诊断均符合文献[4]的标准。陈旧性结核是指影像学发现患者肺上出现的典型硬结、纤维化和钙化，而患者自身无结核中毒症状，无病理学、细菌学阳性结果，亦无PPD强阳性结果及血红细胞沉降率增快等结核病活动证据。在随后的胸部X线复查时，患者肺部的病变不出现任何变化。或患者曾经患过结核，经过治疗完全痊愈或未经治疗自行痊愈者。

2.仪器和试剂：HealForce培养箱，T-SPOT.TB试剂盒(Oxford Immunotec Ltd， 英国)；酶联免疫荧光斑点分析仪(AID公司，德国)；Thermo Scien-tific Sorvall ST 40系列离心机、淋巴细胞分离液、Gibco AIM-V、Gibco RPMI 1640细胞培养液(上海复星长征医学科学有限公司)。

二、方法

1.分离血外周淋巴细胞：用肝素抗凝管采集患者刚入院时未开始治疗前清晨空腹外周血4 ml,常规分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，用细胞培养基AIM-V将细胞悬起，计数后细胞悬液浓度调至1.0×106个/ml。

表1 103例活动性结核病患者资料

2.制备胸腔、腹腔、心包积液及脑脊液单个核细胞：50 ml无菌注射器留取患者刚入院未开始治疗前新鲜非血性胸腔、腹腔或心包积液50 ml,1250 U肝素抗凝。高压灭菌离心管采集该标本10 ml, 20 ℃、1800 r/min, 离心7 min，离心半径17.4 cm；弃上清,将管底细胞悬起,培养基洗涤,加培养基3 ml，作稀释，缓慢加入内有3.5 ml淋巴分离液中，使稀释血液重叠于分离液上。20 ℃、2300 r/min，离心22 min(离心半径16.9 cm), 取出悬浮于血浆和分离液间的PBMCs，用培养基洗涤2次，20 ℃、1800 r/min，离心7 min (离心半径17.4 cm)。用细胞培养基AIM-V将细胞悬起, 计数后调整细胞悬液浓度至1.0×106个/ml。

3.ELISPOT检测：在已包被γ干扰素单克隆抗体的96孔板上，分别加入50 μl细胞培养基作为空白对照，50 μl植物血凝素作为阳性对照，50 μl结核分枝杆菌特异性混合多肽ESAT-6和CFP-10作为刺激源。然后每个孔中加入100 μl上述细胞悬液，每个标本点4个孔。把96孔板放在37 ℃培养箱培养16～20 h后，用pH值7.4的PBS洗液洗板4次，每次200 μl。然后加入碱性磷酸酶标记的二抗，再4 ℃孵育1.5 h。孵育后用pH值7.4的PBS洗液洗板4次，每次200 μl，最后每孔加入50 μl显色底物液，室温避光静置5 min,去离子水终止反应。

4.结果判定：(1)实验有效的判定：空白对照内斑点形成细胞(spot forming cell, SFC)计数<10个，且阳性对照孔内SFC计数>20个。(2)阳性结果的判定：a.检测孔SFC-阴性孔SFC计数≥6个；b.空白对照孔内SFC计数≥6个, 检测孔必须>2倍空白对照孔的SFC计数。(3)最终SFC计数判读：检测孔内SFC计数-阴性对照孔内的SFC计数×4，结果记作：SFC/106，其中一项阳性结果则结果判定为阳性，阳性阈值是结果≥24个SFCs/106。试验全程由我院风湿免疫科化验室经过专业化培训的实验员操作。

5.统计学方法：检测结果用SPSS 16.0 软件处理，计量资料为非正态分布，采用中位数和上下四分位数表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验，计数资料采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.结核性疾病患者T-SPOT.TB检测结果：活动性结核与陈旧性结核病患者混合肽ESAT-6和CFP-10总SFC中位数分别为502个/106PBMCs和430个/106PBMCs, 四分位数间距(P25, P75)分别为(217个/106PBMCs,1287个/106PBMCs)和(140个/106PBMCs,1303个/106PBMCs)，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，差异无统计学意义(U=429.5，P=0.585)。肺结核与肺外结核患者混合肽ESAT-6和CFP-10总SFC中位数分别为456个/106PBMCs和528个/106PBMCs, 四分位数间距(P25, P75)分别为(264个/106PBMCs,950个/106PBMCs)和(186个/106PBMCs,1244个/106PBMCs)，两组间差异无统计学意义(U=1083.0，P=0.871)。

2.本组患者T-SPOT.TB检测结果及与其他检测方法的比较：本组587例患者中T-SPOT.TB阳性者187例,其中确诊结核病患者106例，阳性预测值56.68%(106/187)；400例阴性者中确诊非结核病患者378例，阴性预测值 94.50%(378/400)(表2)。T-SPOT.TB检测结果与患者的性别、年龄、病程无关。PPD、抗酸杆菌涂片、Mtb-Ab诊断结核病的特异度分别为91.87%(192/209)、100.00%(302/302)、93.42%(71/76)，均高于T-SPOT.TB的特异度[82.35%(378/459)]，组间比较采用χ2检验， T-SPOT.TB与PPD比较(χ2=10.382,P=0.01)、T-SPOT.TB与抗酸杆菌涂片比较(χ2=33.842,P=0.00)、T-SPOT.TB与Mtb-Ab比较(χ2=5.921,P=0.08),差异均有统计学意义，其余比较结果见表3。

讨 论

近年来, T-SPOT.TB 试验技术在结核分枝杆菌感染诊断方面被证明具有较高的敏感度和特异度, 且此项技术于2006年通过了英国国家临床最优化研究所(National Institute of Clinical Excellence,NICE)认证,相关报道日益增多[2,5]。一项荟萃了3个研究的Mata分析[6]中，2个是分别在南韩和日本普通流行区的研究，T-SPOT.TB的特异度分别为84.73% (111/131)、83.33%(70/84)；1个是在德国低流行区的研究，T-SPOT.TB的特异度为97.50% (39/40)。本研究非结核性疾病患者中免疫损害者与非免疫损害者T-SPOT.TB的特异度分别为71.37% (172/241)、94.50%(206/218)。这些研究结果提示在低危人群检测T-SPOT.TB的特异度高，而检测有潜在Mtb感染的高危人群时，T-SPOT.TB的特异度明显降低。

本研究中，阳性预测值56.68%(106/187)，阴性预测值 94.50%(378/400)，活动性结核病的检测敏感度为93.20%(96/103)，与Kang等[7]报道的结果相似，陈旧性结核病的检测敏感度为40.00% (10/25)，活动性结核病与陈旧性结核病患者的SFC计数的中位数分别为502个/106PBMCs、430个/106PBMCs，两者比较差异无统计学意义(U=429.5,P=0.585)，肺内结核与肺外结核之间的SFC计数比较，差异亦无统计学意义(U=1083.0，P=0.871)。提示该试剂盒在结核病的检出方面具有较高的敏感度，是筛查结核病的敏感指标，但不能鉴别结核病是活动性、陈旧性或潜伏性感染，与国外一些报道相似[8]，而T-SPOT.TB阴性排除结核病的意义更大。

本研究中，免疫损害者的假阳性率高达28.63%(69/241)，明显高于非免疫损害者的假阳性率(5.50%，12/218),说明免疫抑制状态患者T-SPOT.TB阳性率较高，免疫抑制状态并不影响T-SPOT.TB的敏感度，支持Kim等[9]的观点，这些患者可能有发生活动性结核病的潜在风险，需密切随访。

本研究中T-SPOT.TB检测诊断结核性疾病敏感度为82.81%(106/128),均高于PPD [35.71%(30/84)]、抗酸杆菌涂片[8.74%(9/103)]及Mtb-Ab[14.06%(9/64)]的敏感度。而T-SPOT.TB检测的特异度为82.35%(378/459),均不及PPD[91.87%(192/209)]、抗酸杆菌涂片[100.00%(302/302)]、Mtb-Ab [93.42%(71/76)]的特异度,差异有统计学意义(P<0.05)。表明T-SPOT.TB检测与现有的一些结核诊断手段相比，具有明显的优势，但特异度相对较低，诊断需结合临床。

表2 各组患者T-SPOT.TB检测结果

注a：特异度；b：假阳性率

表3 T-SPOT.TB检测与其他结核诊断方法检测结果的比较

注由于是回顾性分析，部分患者未行PPD、抗酸杆菌涂片和Mtb-Ab检查

本研究中结核性胸膜炎26例，结核性腹膜炎11例， T-SPOT.TB的敏感度为100.00%(37/37)；结核性心包炎2例，阳性者1例，因例数较少需进一步研究。表明T-SPOT.TB试验用来诊断活动性结核性胸膜炎及腹膜炎的敏感度很高，当胸、腹腔积液中无结核分枝杆菌特异性细胞几乎可以排除活动性胸膜结核，但因有一定的假阳性率，故阳性结果需要综合其他的临床表现及相关检查明确诊断。

总之，T-SPOT.TB 在结核病诊断方面具有较高的敏感度[10]，尤其是浆膜腔积液及活动性结核病[11]，受机体的免疫状态影响较小，不受卡介苗接种的影响，在活动性肺结核、肺外结核、潜伏性结核感染及免疫抑制的结核病患者均能检测，诊断快速，24 h出结果，能早期诊断结核分枝杆菌感染。同时，当结核分枝杆菌被清除后，效应T细胞即消失，故检测效应T淋巴细胞可进行临床疗效评估。由于效应T细胞有向胸膜腔聚集的特点，故检测胸腔积液中的单个核细胞能更加灵敏、准确地反应结核分枝杆菌感染的状态，与外周血T-SPOT.TB联合应用，能更有效、准确地诊断结核性胸膜炎。T-SPOT.TB试验也存在一些不足，其检测步骤繁琐,价格昂贵,对实验室和技术要求较高，限制了其在基层医院的开展；另外，尚缺少大量、客观的临床试验数据。此外,结核分枝杆菌感染后的免疫反应与结核病的发生、发展及转归的关系尚未完全明了，所以T-SPOT.TB检测尚不能完全鉴别结核病是否为活动性、陈旧性或潜伏性。

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