大孔树脂纯化番石榴多酚的工艺优化

曹增梅，黄 和(广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088)

番石榴(Psidium guajava L)，又名鸡矢果、拔子，属于桃金娘科(Myrtaceae)，番石榴属(Psidium)，常绿多年生的灌木植物，现在台湾、广东、广西、福建等省均有栽培［1］。植物多酚是一种具有多羟基化合物的总称，具有抗氧化、抗病毒、抑菌消炎等功效［2］。已有研究表明番石榴中含有没食子酸、儿茶素、槲皮素、香草酸等多种多酚类物质，具有较强的抗氧化功能［3］，但目前对番石榴多酚的研究较少，尚无番石榴多酚纯化方面的研究报道，可见对番石榴中多酚类物质的研究很有必要。大孔树脂是一类不溶于酸、碱和各种有机溶剂，具有较好吸附性的有机高分子聚合物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附量大、选择性好、吸附速度快等优点［4］，近年来大孔树脂在黄酮、多酚等活性物质的分离纯化的应用越来越广泛［5-6］。本文通过考察大孔树脂对番石榴多酚的纯化效果，通过吸附、解吸实验，选择适宜的树脂，并对其分离纯化工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番石榴 购于湛江爱佳超市，产地湛江;大孔树脂AB-8、S-8、D101、NKA-9 上海摩速科学器材有限公司;大孔树脂HP-20 日本三菱化学公司;其他试剂 均为国产分析纯。

KQ-500DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE-3000A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;722S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;BL-620S电子天平 日本SHIMADZU公司;SIGMA3-18K高速冷冻离心机 北京博励行仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.2 多酚含量的测定 以没食子酸为标准品，采用Folin-ciocalteu(FC)法测定番石榴中多酚总含量［7］，称取没食子酸 0.05g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，得浓度为0.05mg/mL的标准液，准确吸取0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8mL 置于 50mL 的棕色容量瓶中，分别加入FC试剂4.0mL，混匀，在0.5～5min内加入4mL 10%Na2CO3溶液，充分混合后定容，室温下避光放置lh，以不加标准液的溶液为空白对照，在760nm波长下测定吸光度值，每个样品平行测定3次。

1.2.3 大孔树脂的预处理 树脂分别用95%乙醇浸泡24h，充分溶胀，用倾倒法去除上浮的树脂碎片和杂物，更换乙醇浸泡，直至上清液加适量水后无混浊，再用1mol/L HCl溶液浸泡8h，蒸馏水冲洗至中性，然后用1mol/L NaOH溶液浸泡8h，最后用蒸馏水冲洗至中性，备用。

1.2.4 大孔树脂静态吸附与解吸

1.2.4.1 静态吸附实验 准确称取1.0g湿树脂于50mL锥形瓶中，加入样品溶液10mL，置于摇床上振荡12h，过滤，测定滤液中多酚的含量，根据以下公式计算吸附量、吸附率，考察样品溶液的pH对树脂吸附性能的影响。

式中:Q为吸附量，mg/g;A为吸附率，%;C0为起始浓度，mg/mL;C1为平衡浓度，mg/mL;V为吸附溶液体积，mL;W为树脂重量，g。

1.2.4.2 静态解吸实验 将充分吸附后的树脂用蒸馏水清洗至树脂表面无提取溶液残留，用滤纸吸干水分，加入乙醇溶液30mL，置于摇床上振荡12h，充分解吸后过滤，测定滤液中多酚含量，按式(3)计算解吸率，考察洗脱液的浓度和pH对树脂洗脱性能的影响。

式中:B为解吸率，%;C2为解吸液中多酚浓度，mg/mL;V为吸附溶液体积，mL;W为树脂重量，g;Q为吸附量，mg/g。

1.2.5 大孔树脂动态吸附与解吸 将预处理好的大孔树脂湿法装入玻璃层析柱(1.6cm×40cm)中，蒸馏水平衡后，将样品溶液以一定的流速上柱并收集流出液，每4mL为一管，根据流出液的浓度，计算多酚动态吸附率，考察样品溶液流速、样品溶液浓度等因素对树脂吸附性能的影响，确定最佳吸附工艺条件。

三是无法剥离型财产。关联性企业中往往存在着交叉型财产，所谓交叉型财产是在企业合法运营程序和非法运营本质的共同作用下产生的财产。这部分财产不具有典型的涉黑财产本质，但在财产获取或者流向上存在部分非法的状态。由于财产具有不可分性或者财产非法成分具有不可估价性，或许会导致合法财产无法从中予以剥离的情形。为了从根本上打击关联性企业，应当将此部分财产作为单纯性涉黑财产来进行整体性处置，但是存在善意相对人的情况应当保留其对财产的相关诉讼权利，以做到公平公正、不伤及无辜。

对已吸附饱和的树脂进行洗脱实验，用蒸馏水洗至无还原糖，以一定的流速用适当浓度的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，通过计算解吸率，考察洗脱液体积、洗脱流速等对树脂洗脱性能的影响，确定最佳洗脱条件。按优化后的条件上柱，吸附、洗脱，收集洗脱液，绘制动态洗脱曲线，合并含量高的洗脱液，制成番石榴多酚粉末，计算回收率和纯度。

式中:R为回收率，%;C0为粗提液多酚的起始浓度，mg/mL;V0为上样液的体积，mL;C2为洗脱液中多酚浓度，mg/mL;V2为洗脱液体积，mL;M为多酚样品的重量(干重)，mg;P为样品中多酚的纯度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以没食子酸在反应体系中的质量浓度为横坐标(x，μg/mL)，吸光度值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，见图1。得到的回归方程为:y=0.11x+0.014，R2=0.9994，说明该曲线具有较好的线性关系。

图1 没食子酸标准曲线图Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 树脂筛选结果

大孔树脂的物理结构与化学性质不同，对多酚的吸附和解吸效果也不同，表1显示了5种大孔树脂对番石榴粗提液中多酚的静态吸附量、吸附率和解吸率。

表1 5种大孔树脂静态吸附和解吸性能的比较分析Table 1 Static adsorption and desorption analysis of five macroporous resins

由表1可知，树脂NKA-9的吸附量明显高于其他树脂，可能是因为NKA-9的极性与番石榴多酚的极性相近，而且，NKA-9的解吸效果较好，故确定NKA-9为分离纯化番石榴多酚的最佳树脂。

2.3 静态吸附与解吸条件的优化

2.3.1 粗提液pH对树脂吸附效果的影响 吸附过程中吸附质以分子形态容易被吸附剂吸附，因此吸附要达到较好的效果，必须使吸附质保持分子状态［8］。如图2所示，当 pH为2时，树脂对多酚的吸附效果最好，随着酸性减弱，多酚的吸附量逐渐减少，这是因为多酚具有酚羟基，易于电离，酸性条件保证多酚以分子形态存在，故吸附效果好。

2.3.2 乙醇浓度对树脂解吸效果的影响 如图3所示，随着乙醇浓度的提高，解吸率逐渐增大，当乙醇浓度达到50%后，进一步增大乙醇浓度，解吸率增加不明显，这可能是由于解吸剂的极性在一定程度上影响吸附质的解吸［9］。实验中为了减少试剂浪费，节约成本，选用50%的乙醇对番石榴多酚进行洗脱。

2.3.3 解吸液pH对解吸效果的影响 如图4所示，随着解吸剂pH的增大，解吸能力逐渐增强，pH为3.0时达到最大，pH继续升高，解吸率反而下降。这可能是因为pH为3.0时，树脂与多酚之间的相互作用较弱，多酚易被洗脱。

图2 pH对多酚吸附量的影响Fig.2 Effect of pH on adsorption capacity of polyphenols

图3 乙醇浓度对多酚解吸率的影响Fig.3 Effect of ethnol concentration on adsorption rate of polyphenols

图4 pH对多酚解吸率的影响Fig.4 Effect of pH on desorption rate of polyphenols

2.4 动态吸附与解吸条件的优化

2.4.1 上柱流速对树脂吸附效果的影响 一般来说上样速度慢，有利于树脂对多酚的吸附，流速过快，样液中部分多酚物质会来不及扩散到树脂的内表面，就被冲出柱子，导致树脂对多酚物质吸附量降低，但流速过低，操作时间长，影响生产效率［10］。如图5，随着流速的增加，多酚的吸附量逐渐降低，在0.5、1.0mL/min速率下，树脂的吸附率相差不大，因此选择速率为1.0mL/min。

2.4.2 上样浓度对树脂吸附效果的影响 一般来说，大孔树脂的吸附量一般与上样浓度成反比，低浓度有利于吸附［11］。如图6所示，上样浓度较低时，吸附率变化不明显，随着上样浓度的增加，树脂的吸附率逐渐降低，所以吸附液浓度以1.2mg/mL为宜。

2.4.3 解吸剂流速对树脂解吸效果的影响 解吸流速一般要求慢，因为流速过快，解吸带宽，且拖尾严重，解吸不完全，但流速过慢，又会延长生产周期［8］，生产中应综合考虑。如图7所示，随着解吸速率的增加，解吸率逐渐下降，解吸速率为1mL/min时解吸效果较好，因此选择解吸剂流速为1mL/min。

图5 流速对多酚吸附率的影响Fig.5 Effect of flowing rate on adsorption rate of polyphenols

图6 多酚浓度对吸附率的影响Fig.6 Effect of polyphenols concentration on adsorption rate

图7 流速对多酚解吸率的影响Fig.7 Effect of flowing rate on desorption rate of polyphenols

2.4.4 动态洗脱曲线 如图8可以看出，NKA-9树脂上吸附的多酚物质极易洗脱，多酚的洗脱峰相对集中，对称，无拖尾现象。当洗脱量达到30管时，洗脱液中多酚含量已经很低，可认为已基本洗脱完全，因此，洗脱量为3BV 50%的乙醇。

2.5 验证实验

称取一定量的番石榴多酚粗提物，用蒸馏水溶解，按上述确定的优化工艺条件上柱、吸附，洗脱，收集流出液和洗脱液，经浓缩、干燥得精制番石榴多酚产品，重复3次实验，多酚的平均吸附率和解吸率分别为90.5%和89.3%，产品纯度为46.5%。

3 结论

3.1 通过静态吸附和解吸实验得出，NKA-9具有良好的吸附性能，是初步分离纯化番石榴多酚的优良材料。

图8 NKA-9大孔树脂动态洗脱曲线Fig.8 Dynamic elution curve of NKA-9 resin

3.2 当样液多酚浓度为1.2mg/mL，pH为2时，以1.0mL/min的流速上样，NKA-9型树脂对番石榴多酚的吸附率最高，达到90.5%。

3.3 以50%的乙醇作为洗脱剂，pH为3，洗脱速度为1mL/min时，洗脱效果较好，洗脱率可达89.3%，洗脱液经过冷冻干燥，多酚纯度达到46.5%。

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