慢性乙醇中毒脑β-淀粉样前体蛋白与外伤性蛛网膜下腔出血死亡的关系

魏 来 ，雷怀成 ，于晓军 ，赖小平 ，钱 红 ，徐小虎 ，朱方成

（1.湖北医药学院法医学教研室，湖北 十堰 442000；2.汕头大学医学院法医学教研室，广东 汕头 515041；3.广东医学院法医学教研室，广东 东莞 523808；4.南华大学附属南华医院病理科，湖南 衡阳 421002）

在法医学检案实践中，常有酗酒者头颈部遭受轻微外力打击后发生外伤性蛛网膜下腔出血（traumatic subarachnoid haemorrhage，TSAH）死亡的案例，经系统组织病理学检查未发现明显颅脑损伤或脑血管畸形等相关病变。TSAH造成的死亡一般为酗酒、外伤等多种因素共同参与的结果，目前尚不完全清楚其发生及死亡机制，在死亡原因分析方面往往出现争议，影响了案件的法医鉴定和审判量刑[1-2]。研究[3]显示，各种脑损伤均可影响β-淀粉样前体蛋白（beta-amyloid precursor protein，β-APP）表达。本实验建立大鼠慢性灌酒后脑震荡模型，观测脑组织神经元β-APP的表达，探讨慢性灌酒与脑震荡致TSAH死亡的相关机制，为法医病理学提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

CL级成年雄性SD大鼠60只 （第四军医大学实验动物中心提供），体质量（300±30）g，随机分为灌水组15只、灌水打击组15只、灌酒组15只、灌酒打击组15只。

灌酒组和灌酒打击组：于每天9：00和16：00用食用白酒（52%vol北京红星二锅头）灌胃4周，前2周每次8mL/kg、后2周每次12mL/kg[4-6]；灌水组和灌水打击组以等量饮用水灌胃，余同样处置。

1.2 主要试剂与仪器

β-APP多克隆抗体（英国Abcam公司），兔即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司），山羊血清（福建迈新生物技术开发有限公司）。IM50显微镜（德国Leica公司），Image-Pro Plus 6.0病理图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

1.3 建立TSAH模型

参照Wang等[6-8]建立脑震荡模型的方法，最后1次灌胃后2h，将灌水打击组和灌酒打击组大鼠固定在自制单摆打击装置上，颈下衬垫光滑有机玻璃枕使头部上仰45°，摆锤上举至初始角135°，自由下落，打击枕外隆凸部。观察2h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后股动脉放血处死，立即开胸主动脉插管灌注2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，30min后开颅取全脑。

1.4 染色及图像处理

全脑旁正中矢状切取大脑-小脑-脑干，左右侧取额叶、海马、小脑、脑干组织块分别常规石蜡组织切片HE染色、免疫组织化学染色。SP法：石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2去离子水孵育15 min，阻断内源性过氧化物酶，微波抗原修复预处理，滴加山羊血清封闭，滴加一抗稀释液（1∶100） 60 μL，PBS 替代一抗阴性对照，4℃冰箱过夜，滴加快捷型酶标羊抗兔IgG聚合物滴约 60 μL，37 ℃孵育 20～30 min，PBS 冲洗，DAB 显色，苏木素复染 3～5min，脱水、透明、封片。

IM50显微镜观察并拍照，β-APP阳性结果为胞浆黄色至深棕褐色颗粒，显微镜400倍视野下选择5个视野，Image-Pro Plus 6.0病理图像分析系统测算累积光密度值（integral optical density，IOD）。

1.5 统计学分析

SPSS 17.0统计软件处理实验数据，采用ANOVA方差分析、独立样本t检验比较各组β-APP IOD值，χ2检验对TSAH发生率及死亡率进行比较。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 一般状态

大鼠灌酒后短时间内出现活动度增加、兴奋性增强、易激惹，之后出现步态不稳、运动迟缓，肌张力降低，侧卧、昏睡、翻正反射消失、对刺激反应迟钝等醉酒状态，随着灌酒次数的增加，逐渐出现毛发粗糙、无光泽，精神状况差，体形消瘦，营养不良，进食量减少，活动减少，肢体瘫软等慢性乙醇中毒改变。灌酒打击组死亡大鼠在打击后出现张口呼吸、四肢剧烈抽搐、摆尾后数分钟内死亡。存活大鼠数小时后状态好转。

2.2 TSAH发生率及死亡率

根据Fisher分级法[4]，灌酒打击组大鼠TSAH级别高于灌水打击组。灌酒打击组TSAH发生率和死亡率分别为80.0%、46.7%，显著高于灌水打击组（TSAH发生率和死亡率分别为13.3%、13.3%，P＜0.05）。

2.3 系统解剖及组织病理学观察

灌水组脑表面光滑，神经元、胶质细胞形态和分布正常（图1A）。

灌水打击组全脑轻度淤血，神经细胞轻度水样变性（图 1B）。

灌酒组全脑表面轻度淤血，可见血管纹理，神经纤维粗细不均，排列稍疏松、间隙增大，多见散在暗神经元（图 1C）。

灌酒打击组脑表面弥漫性淤血，脑干周围多见厚层斑片状TSAH，未见明显脑挫裂伤。大脑神经元及胶质细胞弥漫水样变性，中央尼氏体不同程度消失，周隙扩大；多见核固缩、溶解、消失，噬神经及卫星现象，神经元脱失，胶质细胞增生；小脑蒲肯野细胞明显减少，染色、疏密不均、核固缩；延髓多见红色神经元及暗神经元；神经纤维疏松水肿、不规则增粗、扭曲、断裂，局部肿胀明显（图1D）。

2.4 免疫组织化学染色结果

灌酒组额叶、海马、小脑、脑干β-APP IOD值显著高于灌水打击组；灌酒打击组额叶、海马、小脑、脑干β-APP IOD值显著低于灌酒组（表1）。各组额叶、海马、小脑、脑干β-APP阳性表达，可见神经元胞浆内弥漫细小颗粒状或小片状黄褐色染色，其中灌酒组强阳性表达，灌水打击组、灌酒打击组阳性强度相对较弱（图 2～5）。

图1 大鼠脑干组织病理学观察 HE×400

表1 各组大鼠脑组织不同部位β-APP染色IOD值分析 （n=15，±s）

表1 各组大鼠脑组织不同部位β-APP染色IOD值分析 （n=15，±s）

注：1）与相邻上组比较，P＜0.05

组别 额叶 海马 小脑 脑干灌水 11.22±1.40 3.09±0.22 4.88±0.71 7.61±1.38灌水打击 15.18±1.661） 7.97±1.061） 12.58±1.821） 21.01±2.031）灌酒 17.07±2.361） 27.01±4.841） 29.09±3.231） 27.28±2.681）灌酒打击 14.16±1.531） 12.50±1.631） 13.24±2.231） 20.26±2.501）

图2 大鼠额叶β-APP蛋白免疫组化染色 SP×400

图3 大鼠海马β-APP蛋白免疫组化染色 SP×400

图4 大鼠小脑β-APP蛋白免疫组化染色 SP×400

图5 大鼠脑干β-APP蛋白免疫组化染色 SP×400

3 讨 论

本实验观察到灌酒大鼠轻微脑震荡后TSAH发生率和死亡率分别为80.0%和46.7%，显著高于灌水打击组，提示慢性乙醇中毒具有不容忽视的相关脑血管、凝血和神经毒理学效应。

灌酒组脑干等部位神经纤维粗细、疏密不均，多见散在暗神经元，表明长期酗酒可引起神经元和神经纤维组织结构损害。灌酒打击组轴索不规则断裂、扭曲、增粗、周隙扩大等脑震荡性轻微轴索损伤改变，与文献[6-8]报道的慢性乙醇中毒引起缺血性神经元损伤，白质疏松，轴索、胶质细胞缺失，脑萎缩一致。因此，认为慢性乙醇神经毒理学改变，与轻微的脑震荡打击存在协同作用，共同参与TSAH高发生率和高死亡率的病理学机制。

β-APP是一种神经元快速反应性蛋白，具有促进快速轴浆转运、神经营养活性、跨膜信号传导、稳定Ca2+通道等功能。在脑组织机械性损伤、缺血缺氧、兴奋性毒素等因素下，可诱导β-APP增高。本实验证实，大鼠额叶、海马、小脑、脑干β-APP的IOD值在灌酒组较灌水打击组显著增高，灌酒打击组较灌酒组显著降低。提示酗酒的神经毒理学效应可增加β-APP表达，在慢性乙醇毒理作用与外力打击作用下，代偿能力下降，其表达量显著降低。β-APP大量表达，异常裂解产生Aβ，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达，破坏Ca2+稳态，增加兴奋性神经递质的神经毒性，并通过去甲肾上腺素及其他内源性活性物质增加血管收缩性，导致神经元缺血性损伤，同时，氧自由基产物增加，损伤细胞膜、细胞器和细胞骨架，促神经细胞凋亡；其亦可促使Tau蛋白过磷酸化，破坏微管，导致神经元胞体和轴索之间运输障碍，神经纤维末端突触退行性变，形成神经纤维缠结等[9-12]。在慢性乙醇毒理作用与外力打击作用下，降低了β-APP维持Ca2+通道稳定、信号传导、营养等生理功能。因此，认为酗酒引发的β-APP过表达及其异常裂解产生Aβ，可能是参与灌酒和脑震荡打击致TSAH死亡的机制之一。

综上，本研究发现长期酗酒引发脑组织β-APP过量表达，与其他乙醇中枢神经系统毒理学慢性累积作用一起，协同脑震荡性损伤，发生急性大面积蛛网膜下腔出血，颅内压增高、脑水肿、组织结构损害，最终致中枢神经功能障碍。乙醇及其代谢产物的毒理作用除中枢神经系统外，还涉及全身多个器官系统，慢性酗酒的毒理学作用导致TSAH高发生率和死亡率应是多方面因素共同作用的结果[13]，有待进一步研究。

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