青蒿反义鲨烯合酶基因植物表达载体PBI121－SS的构建

罗晓莉 周耀芳

广州中医药大学青蒿研究中心生物技术室，广东 广州 510405

青蒿反义鲨烯合酶基因植物表达载体PBI121－SS的构建

罗晓莉 周耀芳

广州中医药大学青蒿研究中心生物技术室，广东 广州 510405

目的：利用基因工程对野生青蒿进行人工操纵来提高其青蒿素生产能力。方法：从已有载体pROKII－SS通过PCR获得鲨烯合酶基因（SS），然后连接pMD－18载体，测序后，酶切，连接表达载体PBI121－SS，通过菌液PCR，抽取质粒，酶切检测。结果：通过上述方法植物表达载体PBI121－SS构建成功，并转化农杆菌LBA4404。

青蒿素；反义基因；载体构建

青蒿素（artemisinin）是我国科学家从传统抗疟中药——菊科蒿属的青蒿（Artemisia annua L.）中分离提纯出的含有过氧桥结构的类异戊二烯化合物。其合成的衍生物还有双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚等，它们在疟疾治疗上具有高效、速效和低毒等特点，已成为疟疾流行地区的“灵丹妙药”。可是除青蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。青蒿虽然系世界广布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大，且含量仅占叶片干重的0.5%左右，最多也不超过1%。本研究拟在克隆青蒿鲨烯合酶基因（SS）的基础上，利用根癌农杆菌Ti质粒衍生的双元载体系统构建反义SS基因表达载体，然后利用实验方法转化青蒿外植体和再生转基因植株，通过阻遏青蒿内源SS基因表达以降低类固醇的合成并将碳流引向青蒿素合成的可能性，最终提高青蒿素含量。

1 材料

1.1 菌种和质粒 大肠杆菌DH5α由本实验室保存；pMD－18 T载体购自TaKaRa公司；pROKII－SS载体本实验保存；PBI121载体由本校热研所提供；根癌农杆菌LBA4404（pAL4404）菌株载体购自TaKaRa公司。

1.2 试剂 质粒DNA纯化试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自Life Technologies公司；聚合酶链反应（PCR）扩增试剂盒及逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增试剂盒、Taq酶、限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Takara公司。培养基成分及其他常规化学试剂为国产分析纯产品。

1.3 仪器 PCR仪；台式离心机；凝胶成像分析系统；台式制冷机；高速冷冻离心机；恒温振荡器；微型凝胶电泳仪；紫外分析仪；压力蒸气消毒器；电热恒温水浴锅；超净工作台；脱色摇床；旋涡混合器。

2 方法

2.1 PCR扩增 以实验室的pROKII－SS载体为模板，带有酶切位点的SmaI－SS（5′TCCCCCGGGATGAGTAGTTTGAAAG3′）、BamHI－SS（5′CGCGGATCCTTACAAAGTGAATTC3′）为上下引物，对pROKII－SS进行PCR扩增。扩增条件为：94℃，1分钟→94℃，30秒，后57℃，1分钟，然后72℃，1.5分钟，30个循环→72℃，10分钟→4℃。反应结束后，取5～10μl PCR产物进行电泳检测。

2.2 扩增片段回收 长波紫外观看凝胶，切下含扩增片段的琼脂糖部分，将凝胶放入eppendorf管中，按试剂盒说明书操作。以回收的纯化扩增产物调制下列连接反应：1μl solution I、1μl pMD－18 T载体、5μl PCR产物，3μl H2O、16℃反应过夜。

2.3 大肠杆菌感受态细胞的转化 加入3～5μl连接产物至感受态细胞，混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒，迅速冷却1～2分钟，加入1m l LB培养基，37℃振荡培养1.5h；取200μl菌液涂于含100mg／L Amp的筛选平板上，吹干，37℃倒置培养12～16小时。

2.4 重组质粒鉴定 挑取单菌落，摇菌并提取质粒，分别经PCR扩增及SmaI，BamHI酶切鉴定。PCR扩增采用Taq酶，反应条件为：94℃，1分钟→94℃，30秒，后57℃，1分钟，然后72℃，1.5分钟，30循环→72℃，10分钟→4℃。DNA酶切反应条件（30μl体系）：1.0－2.0μg质粒DNA、3μl 10×T缓冲液、SmaI 1.5μl，BamHI 1.5μl，加ddH2O至终体积30μl，置30℃反应2～3小时。

2.5 重组质粒测序 重组后的质粒进行测序，核对为反义基因SS且序列正确无误。

2.6 目的基因与超表达载体的酶切 经测序后确认SS无误后，将pMD18－SS质粒和PBI121质粒用SmaI，BamHI做双酶切，酶切体系为（30μl体系）：1.0～2.0μg质粒DNA、3μl 10×T缓冲液、SmaI 1.5μl，BamHI 1.5μl，加ddH2O至终体积30μl，置30℃反应2～3小时。

2.7 目的基因与超表达载体的连接 经双酶切的目的基因和表达载体，用纯化试剂盒纯化后，进行连接，连接体系（10μl体系）：200ng SS片段、250ng PBI121质粒，1μl 10 ×连接缓冲液、1U T4DNA连接酶，加ddH2O至终体积10μl，置16℃反应过夜。

2.8 大肠杆菌转化与鉴定 方法同2.3和2.4。

2.9 农杆菌细胞转化与鉴定 低温冰箱中取出100μl感受态细胞悬液，室温解冻，立即置冰上，加0.1μg PBI121－SSDNA溶液，轻混匀，冰上放置10分钟。置于液氮速冻5分钟，28℃水浴热激5分钟。加入500μl YEB液体培养基，28℃缓慢振荡培养2～3小时，使细菌恢复正常生长状态。取上述菌液100μl涂布于含Rif（50μg／m l）及Kan（25μg／m l）的YEB筛选平板上，放置30分钟，待菌液完全被培养基吸收后，28℃培养24～48小时。经PCR扩增鉴定阳性克隆。

3 结果

3.1 青蒿SSDNA扩增 载体Prok II－SS经PCR扩增后，经10%凝胶电泳可见一条长度约1250bp的带。由电泳结果可知，青蒿SS基因已从载体Prok II－SS中扩增出来，其大小符合理论长度。见图1。

3.2 目的基因与载体的连接 将PCR扩增片段插入pMD18－T载体后获得的重组质粒命名为pMD18－SS。抽取pMD18－SS的质粒做双酶切，经1%凝胶电泳后，可见与青蒿DNA的PCR产物大小相当的区带，表明上述扩增片段已经与载体连接。见图2。

3.3 反义SS基因超表达载体PCR鉴定 将经过双酶切连接重组后质粒命名为PBI121－SS，将其导入大肠杆菌DH5α后提取质粒进行PCR检测，结果显示SSDNA片段已扩增，说明PBI121－SS已连接成功。见图3。

3.4 反义SS基因超表达载体双酶切鉴定 将PBI121－SS质粒用SmaI，BamHI做双酶切进行进一步的鉴定，结果显示切下的片段与SS基因片段大小一致，说明PBI21－SS超表达载体已经构建成功。见图4。

3.5 反义SS基因超表达载体转化农杆菌鉴定 使用冻融法将PBI121－SS导入农杆菌BA4404，以农杆菌DNA为模板PCR，结果扩增出1259 bp的反义SS基因片段，说明PBI121－SS质粒已导入农杆菌。见图5。

4 讨论

目前，采用基因工程手段培育高产青蒿素品系正在受到国内外学者的关注［1－4］。国内外相继开展了青蒿素生物合成关键酶基因克隆的研究，已克隆出从乙酰CoA合成FDP的关键酶基因，即HMG－CoA还原酶基因（HMGR）和FDP合酶基因（FDPS）。Chen等利用农杆菌转化分别获得转FDPS基因青蒿发根和青蒿植株，其青蒿素含量比非转基因青蒿植株提高了2－3倍［2－3］。由此可见，植物基因工程在青蒿素高产品系的培育上具有很大潜力。

pMD18－T Vector是一种高效克隆PCR的专用载体，由pUC18载体改建而成的，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，再在pUC18载体的多克隆酶切位点处导入了EcoR V酶切位点，使用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3′端添加“T”构成。克隆后的PCR产物无法将载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物中导入合适的酶切位点，此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受T载体上其他多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。

本次实验在青蒿细胞中导入反义SS基因，尝试通过干扰SS基因表达来降低类固醇合成活性［6］。因此，以双元质粒pBI121为基础构建反义SS基因表达载体PBI121－SS，然后利用根癌农杆菌Ti质粒衍生载体，在后续研究中将反义SS基因导入青蒿细胞并再生转基因青蒿植株，试图使青蒿体内的代谢活动朝着更有利于青蒿素合成的方向转变，从而实现青蒿分子育种的目标，并为利于植物基因工程改造中药材进行有益的探索。

［1］Paniego NB，Giulietti AM.Artemisia annua L.：Dedifferentiated and differentiated cultures.［J］.Plant Cell Tiss Org Cult，1994，36（8）：163－168.

［2］Chen DH，Liu CJ，Ye HC.et al.Ri－mediated transformation of Artemisia annua with a recombinant farnesyl diphosphate synthase gene for artemisinin p roduction［J］.Plant Cell Tiss Org Cult，1999，57（3）：157－162.

［3］Chen DH，Ye HC，LiGF.Expression of a chimeric farnesyldiphosphate synthase gene in Artemisia annua L.：Transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens－mediated transformation［J］.Plant Sci，2000，155（5）：179－185.

［4］Han JL，Liu BY，Ye HC.Effects of overexpression of the endogenous farnesyl diphosphate synthase on the artemisinin content in Artemisia annua L［J］.J Integrat Plant Biol，2006，48（4）：482－487.

［5］王满元.青蒿素类药物的发展历史［J］.自然杂志，2012，34（1）：44－47.

［6］冯丽玲.青蒿反义鲨烯合酶基因转化培育青蒿素高产植株的研究［D］.广州中医院大学，2007：32－33.

R284

A

1007－8517（2013）21－0005－02

2013.09.20）

柬埔寨那塔纳基里快速灭源灭疟示范项目（KY－2011－013－4）。

罗晓莉，女，硕士，E－mail：117231216＠qq.com