多烯紫杉醇联合AG490对前列腺癌DU-145细胞增殖凋亡的影响

丁淑云，康绍叁，景中民，郑振武，张秀平，高伟兴

(1河北联合大学附属医院曹妃甸区医院，河北唐山063000;2河北联合大学附属医院;3驻马店市中心人民医院)

联合多烯紫杉醇治疗雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的有效性已得到临床研究证实，但发现其延长患者的生存时间极为有限［1，2］。酪氨酸激酶(JAK)抑制剂AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二睛的脂类衍生物，通过阻断JAK/信号传导及转录激活因子(JAK/STAT)信号通路，能够抑制多种肿瘤细胞生长，诱导其凋亡。2010年12月～2013年1月，我们观察了多烯紫杉醇联合AG490对前列腺癌DU-145细胞增殖凋亡的影响，旨在探讨二者联合应用治疗晚期前列腺癌的可行性及机制。

1 材料与方法

1．1 材料 人前列腺癌细胞株DU-145购自中国科学院上海细胞库。多烯紫杉醇为Sigma公司产品，AG490为Merck公司产品，胎牛血清、胰蛋白酶及F12培养基均为美国Gibco公司产品，噻唑蓝(MTT)购自天津灏洋生物有限公司。Annexin-V凋亡试剂盒为美国BD公司产品。Bcl-2兔抗人多克隆抗体和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物制品有限公司。

1．2 实验方法

1．2．1 细胞培养 将 DU-145细胞(培养于含有90%F12的培养液中)置于含10%胎牛血清，青、链霉素各100 U/mL的培养基中，37℃、5%CO2培养箱内常规培养，每24 h更换培养液1次。细胞90%汇合时用0．25%胰蛋白酶消化传代，每周2、3次，取对数生长期细胞进行实验。

1．2．2 细胞干预及细胞生长抑制率检测 将DU-145细胞以1×105/mL密度接种于96孔培养板中，150μL/孔，每个浓度设6个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。待细胞贴壁后分为三组。紫杉醇组分别加入10、100、1 000 nmol/L的多烯紫杉醇;AG490组分别加入 10、20、40、80 μmol/L的AG490;联合组分为联合1、2、3组，分别加入10、100、1 000 nmol/L的多烯紫杉醇及40μmol/L的AG490，继续培养48 h。对照组不做特殊处理，每天更换F12培养基。终止前4 h每孔加入MTT溶液20μL(5 g/L)，继续培养，终止时吸尽培养液，每孔加入DMSO 50μL水平摇床上振荡10 min，于酶标仪上(波长490 nm)测定各孔吸光度值(OD值)。细胞生长抑制率(%)=1-(药物组平均OD值/对照组OD值)×100%。

1．2．3 细胞干预及细胞凋亡率检测 将DU-145细胞悬液(1×106个)接种于6孔培养板中，紫杉醇组加入浓度为100 nmol/L的多烯紫杉醇;AG490组加入浓度为40μmol/L的AG490;联合组加入上述两种药物(浓度同上)，在37℃、5%CO2培养箱内培养48 h;对照组不做特殊处理，每天更换F12培养基。收集贴壁及悬浮细胞，1 000 r/min，离心5 min，弃上清液。加入PBS(pH=7．4)2 mL洗涤，1 000 r/min，离心5 min。弃上清液，将细胞重悬于200μL Binding Buffer;加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300μL Binding Buffer，l h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1．2．4 细胞干预及Bcl-2表达检测 将DU-145细胞以1×104/mL接种于6孔培养板中，150μL/孔，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。待细胞贴壁后，细胞分组及干预同1．2．3。干预后继续培养48 h，倾去培养液，每孔PBS洗2次，3 min/次，每孔加4%多聚甲醛2 mL，固定细胞30 min，PBS洗2 min×3次，制成细胞爬片。按照免疫组化染色试剂盒使用说明书进行操作，以PBS替代第一抗体作为阴性对照。结果判定:Bcl-2阳性染色为细胞质棕黄色颗粒。排除爬片边缘细胞，随机观察10个高倍视野，计算高倍视野细胞中Bcl-2蛋白阳性细胞百分数，取平均值作标记指数(PI)，PI=(视野中阳性细胞数)/(视野中阳性细胞数+视野中阴性细胞数)×100%。

1．2．5 统计学方法 应用SPSS13．0统计软件进行数据处理。计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验和方差分析。以P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 细胞生长抑制率 不同浓度多烯紫杉醇干预对DU-145细胞生长抑制率的影响见表1，不同浓度AG490干预对DU-145细胞生长抑制率的影响见表2，多烯紫杉醇及AG490联合干预对DU-145细胞生长抑制率的影响见表3。分析表1～表3结果，紫杉醇、AG490及二者联合应用对DU-145细胞增殖均有明显抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。各干预组细胞生长抑制率与对照组(0 nmol/L)比较，P均＜0．05;联合组分别与紫杉醇组及AG490组比较，P均 ＜0．05。

2．2 细胞凋亡率 干预48 h后对照组、紫杉醇组、AG490组及联合组细胞凋亡率分别为(7．25±1．08)%、(27．14 ± 3．27)%、(21．29 ± 3．89)%、(57．45±5．06)%。各实验组与对照组比较，P均＜0．05，联合组分别与紫杉醇组、AG490组比较，P均

表1 不同浓度多烯紫杉醇干预对DU-145细胞生长抑制率的影响(%，¯x ± s)

表2 不同浓度AG490对DU-145细胞生长抑制率的影响(%，¯x ±s)

表3 多烯紫杉醇与AG490联合应用对DU-145细胞生长抑制率的影响(%，¯x±s)

2．3 细胞 Bcl-2蛋白表达 对照组、紫杉醇组、AG490组及联合组 Bcl-2蛋白阳性表达率分别(70．45 ± 5．24)%、(40．15 ± 7．36)%、(31．78 ±6．79)%、(10．05 ±1．24)%，各干预组与对照组比较，P均 ＜0．05，其中联合组分别与紫杉醇组、AG490组比较，P均 ＜0．05;紫杉醇组与 AG490组比较差异无统计学意义。

3 讨论

多烯紫杉醇是一种半合成的紫杉醇类衍生物，研究发现，其可通过促进细胞微管聚合，阻止微管正常的生理解聚，将细胞周期阻滞于G2/M期，影响细胞有丝分裂过程，从而导致肿瘤细胞死亡［3，4］。有报道，多烯紫杉醇联合泼尼松可延长AIPC患者生命，降低死亡风险，疗效及耐受性优于多烯紫杉醇与其他药物联合，目前是AIPC患者的一线标准治疗方案［1］。但其临床疗效并不尽如人意，患者中位生存时间仅为18．9个月，死亡风险仅降低24%。因此，探讨晚期前列腺癌发生激素抵抗的机制和寻找合适的联合药物是目前研究的热点和难点之一。

JAK/STAT信号通路是与细胞生长、增殖、分化关系十分密切的一条信号转导途径。其基本作用模式为:配体与受体结合导致受体二聚化;激活JAK;JAK将STAT磷酸化;STAT形成二聚体，暴露出入核信号;STAT进入核内，调节基因表达［5］。Lee等［6］研究发现，JAK/STAT通路异常激活与包括前列腺癌在内的诸多肿瘤细胞增殖、分化及凋亡密切相关。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二睛的脂类衍生物，结构类似于酪氨酸，可与受体酪氨酸激酶竞争结合位置，特异性阻滞各种细胞因子引起的JAK2和下游分子STAT3的磷酸化激活，从而阻断JAK/STAT信号通路。刘青娟等［7］实验证实，高糖通过激活小鼠足细胞中JAK/STAT信号通路，诱导足细胞转分化，采用AG490进行干预后发现，足细胞中 α-SMA蛋白及其 mRNA表达明显降低。AG490作为抗肿瘤药物已用于临床治疗白血病，特别是对JAK2异常活化导致的前B急性淋巴细胞白血病具有很好的治疗作用，且毒副作用很小［8］，但其应用于治疗前列腺癌的报道较少。

本研究结果显示，多烯紫杉醇和AG490在作用于DU-145细胞24 h和48 h后，随着各自药物浓度的增加，细胞增殖受到显著抑制，且呈时间和剂量依赖性。两者联合作用于DU-145细胞24 h和48 h后，随着多烯紫杉醇浓度的增加，细胞抑制率增加，也呈时间和剂量依赖性;多烯紫杉醇联合AG490在作用于DU-145细胞48 h后，可显著诱导细胞凋亡，其中联合组细胞凋亡率高于紫杉醇组及AG490组。上述结果说明多烯紫杉醇和AG490均可抑制DU-145细胞增殖，诱导其凋亡;二者联合应用有协同作用。

Bcl-2作为抑制凋亡基因家族中一个重要成员，被称为细胞死亡调节因子，其通过抑制细胞的程序性死亡过程而延长细胞的寿命，使细胞的数量增多，基因变异的可能性增加，进而有助于肿瘤的发生发展［9］。Dingemans等［10］的研究显示，多烯紫杉醇能诱导Bcl-2蛋白的磷酸化，导致Bcl-2/bax异二聚体减少，Bcl-2/bax二聚体增加，最终导致肿瘤细胞凋亡。Buettner等［11］研究还发现，STAT的持续激活可以调控Bcl-2基因，导致细胞的异常增殖和恶变，参与肿瘤的发生、发展。因此，阻断该通路成为肿瘤治疗的新靶点。本研究结果显示，各干预组干预后Bcl-2蛋白阳性表达率显著降低，其中联合组Bcl-2蛋白阳性表达率变化明显低于紫杉醇组及AG490组，与上述研究结果一致。说明多烯紫杉醇和AG490诱导DU-145细胞凋亡均可通过Bcl-2介导。

综上所述，多烯紫杉醇和AG490均可抑制DU-145细胞增殖，诱导其凋亡。二者抗癌机制不同，联合应用有协同作用，可提高化疗疗效、降低化疗药物浓度，减轻化疗副作用，防止或延缓肿瘤耐药性的产生。但对于AG490用于AIPC治疗的毒副反应，二者最佳浓度搭配及用药先后顺序等问题还有待于进一步研究。

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［2］Petrylak DP，Tangen CM，Hussain MH，et al．Docetaxel and estramustine compared with mitoxantrone and prednisone for advanced refractory prostate cancer［J］．N Engl J Med，2004，351(15):1513-1520．

［3］Symmans WF，Volm MD，Shapiro RL，et al．Paclitaxel-induced apoptosis and mitotic arrest assessed by serial fine-needle aspiration:implications for early prediction of breast cancer response to neoadjuvant treatment［J］．Clin Cancer Res，2000，6(12):4610-4617．

［4］魏爱英，马春燕，牟文丽．多烯紫杉醇抑制乳腺肿瘤细胞增殖及诱导凋亡的实验研究［J］．山东医药，2005，45(8):22-23．

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［11］Buettner R，Mora LB，Jove R．Activated STAT signaling in human tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention［J］．Clin Cancer Res，2002，8(4):945-954．