肌酐代谢产物对肾小管上皮细胞凋亡的影响

胡白瑛

（柳州市柳铁中心医院肾内科，广西柳州545007）

肌酐代谢产物对肾小管上皮细胞凋亡的影响

胡白瑛

（柳州市柳铁中心医院肾内科，广西柳州545007）

目的研究肌酐产物是否能促进肾小管上皮细胞凋亡。方法原代培养人肾小管上皮细胞，将肌酐产物与肾小管上皮细胞共同培养，对肾小管上皮细胞进行形态学观察；抽提DNA进行琼脂糖电泳观察有无梯形条带。结果肾小管上皮细胞在肌酐产物作用下逐渐变小、变圆、固缩，最后漂浮死亡，但胞膜始终完整；肌酐产物导致肾小管上皮细胞凋亡，琼脂糖凝胶中有DNA梯形条带，加入谷胱甘肽(GSH)未见DNA梯形条带。结论肌酐产物促进肾小管上皮细胞凋亡，GSH可阻断之。

肌酐产物；肾小管上皮细胞；凋亡

慢性肾功能不全进行性恶化的主要病理基础一直被认为是肾小球硬化和肾间质纤维化。近年来发现肾脏细胞调亡也是加剧肾功能不全的主要因素，但诱发细胞调亡及其环节尚不清楚。本文以肌酐代谢产物对肾小管上皮细胞的作用，观察是否有诱发调亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料(1)原代培养的人肾小管上皮细胞；(2)分解肌酐能力最强的尿毒症患者肠道之肺炎克雷伯氏菌；(3)肌酐。

1.2 方法(1)取含0.14 mg/ml肌酐的无蛋白培养液1 ml于Eppendoff管中，每管中加入1菌环肺炎克雷伯氏菌，放入37℃恒温箱培养48 h，然后离心取上清液，矫正pH后过滤除菌，作为肌酐产物备用。在肾小管上皮细胞传代第5 d后，用上清液与完全培养液以1/9的比例混合的混合液代替完全培养液，于倒置显微镜下观察细胞形态。加入谷胱甘肽做为对照组。(2)收集培养了2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的肾小管上皮细胞及对照组的肾小管上皮细胞，细胞数106个，将细胞溶解在裂解液中，37℃保温18 h以上，再用饱和苯酚、氯仿、异戊醇抽提上清液2次，经乙醇-20℃沉淀后，离心30 min，再用适量的TE溶解，加RNase酶5 mg/L，37℃温育1 h，降解RNA后，在加入溴化乙锭的1.6%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察梯形条带并成像。

2 结果

2.1 肌酐产物作用下的肾小管上皮细胞肌酐产物组的肾小管上皮细胞12 h出现形态改变，细胞有较多空泡产生，由扁平伸展逐渐变小变圆，细胞逐渐固缩，但胞膜完整，最后第7天全部脱落悬浮。对照组仅产生少量气泡，无其他表现，见图1～图3。

图1 加入肌酐产物48 h的肾小管上皮细胞（光镜×400）

图2 加入肌酐96 h的肾小管上皮细胞（光镜×400）

图3 加入肌酐7 d的肾小管上皮细胞(光镜×400)

2.2 凋亡的肾小管上皮细胞的梯形条带第一泳道为加入肌酐产物第4天的肾小管上皮细胞中抽提的DNA。第二泳道为100 bp DNA Ladder marker，自下而上依次为100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 000 bp、1 500 bp。第三泳道为加入GSH的对照组。见图4

图4 琼脂糖电泳DNA梯形条带

3 讨论

本实验发现肌酐代谢产物对肾小管上皮细胞的影响出现了以下特点：加入肌酐产物1 d起细胞就开始有变化，1～2 d内细胞内出现大量空泡，第4天细胞明显变小、变圆，继而出现细胞核固缩，但胞膜完整，最后细胞漂浮死亡。符合凋亡的特征。

对细胞凋亡机制的研究表明，半胱氨酰天冬酸特异性蛋白-3(Caspase-3)激活的丝氨酸蛋白-凋亡蛋白酶(AP24)诱导凋亡时细胞核DNA链的碎裂。DNA链碎裂系激活细胞核内的核酸限制性内切酶，使染色体有控降解，DNA在核小体间被切成180～200 bp及其倍数的核苷酸片段，在琼脂糖电泳上呈现特征性的梯形条带。在本实验中我们在不同时段收集细胞进行DNA抽提，并进行琼脂糖电泳，出现了DNA梯形条带，其中以第4天最为明显。说明细菌作用于肌酐的代谢产物确实可引起肾小管上皮细胞的凋亡。实验中加入GSH的第3泳道未出现DNA梯形条带，说明GSH可以预防细菌作用于肌酐的代谢产物引起的肾小管上皮细胞的凋亡。

GSH抗细胞凋亡可能与下列环节有关：(1)GSH含量降低是一种潜在的凋亡早期激活信号。研究认为氧化应激状态下，随着活性氧产生的增加，细胞内GSH含量降低[1]，在外部凋亡刺激的情况下诱发了多种凋亡信号的产生；3 h后可见NFκB(转录因子κ基因结合核因子)的RelA亚基的激活和核易位；24 h后一种缩短形式的p53蛋白呈时间依赖的表达；48～72 h后随着线粒体GSH耗竭和ROS(反应性氧类)产生增加,细胞产生了凋亡。(2)GSH耗竭，DNA易碎裂。在HL-60细胞及PW白细胞，Bcl-2(B细胞淋巴细胞/白细胞-2)基因的过度表达抑制肿瘤坏死因子及紫外线诱发的AP24蛋白酶激活，抑制细胞凋亡；但GSH耗竭及Bcl-2过度表达的细胞对肿瘤坏死因子及紫外线激活的AP24蛋白酶敏感并且产生凋亡；GSH耗竭时Bcl-2过度表达细胞的细胞核对AP24诱导的DNA碎裂敏感性高。

本实验中肌酐代谢产物作用于肾小管上皮细胞就是使其处于氧化应激中，消耗其GSH，使GSH含量降低，肾小管上皮细胞出现了凋亡，故加入GSH可防止凋亡。亦有文献证实脂质过氧化、活性氧、自由基均可引起肾小管上皮细胞的坏死和凋亡[2-3]。

本实验表明细胞凋亡在慢性肾功能衰竭中扮演重要角色。肌酐产物通过诱导肾小管上皮细胞凋亡促进肾小管萎缩，加剧了肾功能衰竭，这是慢性肾衰肾功能恶化机制之一。氧化损伤、GSH减少是引起肾小管上皮细胞凋亡的两个重要因素。这有助于我们寻找新的特异性的治疗手段干预慢性肾功能衰竭，如抗氧化剂GSH的应用。对Bcl 2家族和Caspase等凋亡途径干预来治疗慢性肾功能衰竭，可望在慢性肾衰进行性恶化的控制上提供新的启示。

[1]Armstrong JS,Steinauer KK,Hornung B,et al.Role of glutathionede depletion and reactive oxygen species generation in apoptotic signalingina human B lymphoma cell line[J].Cell Death Differ, 2002,9(3):252-263

[2]Baek SM,Kwon CH,Kim JH,et al.Differential roles of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in cisplatin-induced cell death in renal proximal tubular epithelial crlls[J].J Lab Clin Med,2003,142 (3):178-186

[3]周萍，赵广成，吴玉斌,等.氧化应激对大鼠肾小管上皮细胞生物学行为的影响及L-EGCG的保护作用[J].医学临床研究,2010, 27(10):1804-1808.

Effect of metabolites of creatinine on the apoptosis of renal tubular epithelial cells.

HU Bai-ying.Department of Nephrology,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo study the effect of metabolites of creatinine on the apoptosis of renal tubular epithelial cells.MethodsRenal tubular epithelia were cultured in vitro.The metabolites of creatinine and renal tubular epithelial cells were incubated together.The morphological change of renal tubular epithelial cells was observed.Gel electrophoresis of DNA extracted from that to observe bands of apoptotsis.ResultsAffected by metabolites of creatinine,renal tubular epithelial cells showed characters of apoptosis(smaller,round,pyknosis and death),but the cell membrane was always integral.Agarose gel electrophoresis revealed the appearance of DNA ladder,which disappeared with the addition of GSH.ConclusionThe metabolites of creatinine can induce the apoptosis of renal tubular epithelial cells,which could be reversed by GSH.

Metabolite of creatinine;Renal tubular epithelial cells;Apoptosis

R334+.1

A

1003—6350（2013）09—1268—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0536

2012-11-28)

胡白瑛。E-mail：hubaiying@sohu.com