亚油酸对Lipstatin发酵生产的影响研究

王永青，张小琴，王宇池，韩力挥

（1．中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛266100；2．海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东 青岛266100）

Lipstatin是一种有效的胃肠道胰脂肪酶抑制剂，是毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）的代谢产物。它的氢化产物Orlistat，是一种重要的防治与肥胖相关疾病的药物，不作用于中枢神经系统，副作用小。

Paul等［1］首次公布了Lipstatin的发酵生产工艺和提取工艺，生产菌种为Streptomyces toxytricini NRRL 15443，种子培养基391，发酵合成培养基N16，最高发酵效价为6．23mg·L－1。Adelbet等［2］研究了在含有合适碳源、氮源和无机盐的液体培养基中用放线菌好氧发酵生产Lipstatin的分批补料生产工艺，培养基中不含脂肪酸，在发酵初期补亚油酸和辛酸（或其酯和盐）以及N－甲酰基－L－亮氨酸（优选补料L－亮氨酸），用抗氧化剂稳定亚油酸，但由于脂肪酸毒性的影响以及菌种对亚油酸补料液的代谢能力较低，所以Lipstatin发酵效价仍很低。Varga等［3］研究了用毒三素链霉菌CCM7349发酵生产Lipstatin的工艺过程，在装有40L不含乳化剂的培养基的70L发酵罐中二级发酵，发酵34h后开始补亚油酸和8%的L－亮氨酸溶液，28℃下培养180～230h，最终发酵效价为3．0～3．2g·kg－1。Gasparic等［4］研究了在含有亚油酸的种子培养基和发酵培养基中培养放线菌的发酵工艺，培养基中亚油酸的质量浓度大于0．3%、豆油的质量浓度大于1%，28℃下好氧培养144h，未补料时Lipstatin发酵效价为（556±81）mg·L－1，补料时发酵效价为4773mg·L－1。Fujs等［5］利用毒三素链霉菌的突变菌种，在含有亚油酸前体的培养基中发酵生产Lipstatin，接种后20h补亚油酸和L－亮氨酸，使亚油酸的浓度维持在0．3%～0．5%之间，Lipstatin的发酵效价为4400mg·L－1。

作者在前人研究的基础上，研究了补料亚油酸对Lipstatin发酵生产工艺的影响，并确定了最佳的补料时间和补料速率，拟为工业化发酵生产Lipstatin中亚油酸控制工艺提供依据。

1 实验

1．1 菌种和培养基

菌种：毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini），本实验室优选。

种子培养基（g·L－1）：大豆粉10，甘油10，酵母膏5，亚油酸2，加自来水至1L。用10%NaOH溶液调节pH值至7．0。121℃、0．1MPa下灭菌30min。

发酵培养基（g·L－1）：大豆粉60，甘油30，磷脂14，CaCO32．0，消沫剂SAG 1．0，加自来水至1L。用10%NaOH溶液调节pH值至7．0。121℃、0．1MPa下灭菌30min。

1．2 试剂与仪器

亚油酸，青岛澳海生物有限公司。

反相 HPLC1100型色谱仪，Agilent公司；PHS－3C型精密pH计。

1．3 发酵培养方法

摇瓶种子培养：用无菌水刮洗下斜面菌体，制成菌悬液。取1mL菌悬液接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，置于旋转式摇床27℃、210r·min－1下振荡培养24～36h。

发酵培养：10L发酵罐中培养基装量为6L，接种量10%，27℃、转速450r·min－1，通气1VVm，培养144h。

1．4 分析测试

发酵液pH值：采用精密pH计测定。

菌体浓度（湿菌体量，PMV）：采用湿重法测定，取发酵液置于10mL离心管中，离心（3500r·min－1，10 min），弃上清，以沉降的固体体积占总发酵液体积的百分数为PMV。

发酵液的处理及Lipstatin效价：取10mL发酵液离心（3800r· min－1，10min），上清液用丙酮以1∶4的比例摇匀浸泡2h后再次离心（10 000r· min－1，3min），取上清液进行HPLC分析，测定发酵液的胞外效价；并用同样的方法测定菌丝体沉淀中的产物量（胞内效价）。发酵液总效价为胞内效价和胞外效价之和［6］。

HPLC色谱条件：自动进样器，DAD检测，色谱柱为反相Inertsil C18柱（4．0mm×150mm，3μm）；检测波长200nm；流动相为乙腈－0．1%H3PO4溶液（75∶25）；柱温45℃；流速1．5mL· min－1。

2 结果与讨论

2．1 发酵培养基中初始亚油酸浓度对产Lipstatin的影响

在发酵培养基中加入亚油酸，浓度（g·L－1）分别为0、10、20、30、40、50，考察初始亚油酸浓度对产Lipstatin的影响，结果如图1所示。

图1 初始亚油酸浓度对菌体浓度（a）和Lipstatin发酵效价（b）的影响Fig．1 The effects of initial concentration of linoleic acid on mycelium concentration（a）and lipstatin titer（b）

由图1a可知，适量的亚油酸对菌种生长有明显的促进作用，但若过量则对菌种生长产生抑制作用，这可能是因为亚油酸的毒性所致。当初始亚油酸浓度为30g·L－1时，菌体生长量最大。

由图1b可知，在Lipstatin的生物合成过程中添加一定量的亚油酸是必要的，它对Lipstatin的生成有明显的促进作用，可使Lipstatin的合成时间提前，培养基中添加20g·L－1的亚油酸效果最好，Lipstatin的发酵效价达到6．2g·L－1。

2．2 补料时间对产Lipstatin的影响

在含有20g·L－1亚油酸的发酵培养基中，分别在接种后发酵12h、24h、36h、48h、60h和72h开始补亚油酸，补料速率为0．3g·L－1·h－1，考察补料时间对Lipstatin发酵效价的影响，结果如图2所示。

图2 补料时间对Lipstatin发酵效价的影响Fig．2 The effect of feeding time on lipstatin titer

由图2可知，在接种后36h开始补料，发酵效价最高。这可能是因为，培养36h时菌体生长进入稳定期，Lipstatin开始大量合成，而亚油酸又是Lipstatin合成过程中重要的前体物质，故36h时补料对合成有明显促进作用。

2．3 补料速率对产Lipstatin的影响

控制补料速率（g·L－1·h－1）分别为0．1、0．2、0．3、0．35、0．4、0．5，其它条件不变，考察补料速率对Lipstatin发酵效价的影响，结果如图3所示。

图3 补料速率对Lipstatin发酵效价的影响Fig．3 The effect of feeding rate on lipstatin titer

由图3可知，当补料速率为0．35g·L－1·h－1时，Lipstatin的发酵效价最高，为6．8g·L－1。

3 结论

亚油酸作为Lipstatin生物合成的前体物质，对Lipstatin的发酵有重要影响。在初始亚油酸浓度为20g·L－1的发酵培养基中，接种后发酵36h开始补料、补料速率为0．35g·L－1·h－1时，Lipstatin的发酵效价最高，为6．8g·L－1。

［1］Paul H，Erich H，Ernst K，et al．Leucine derivatives［P］．EP 129 748，1985－01－02．

［2］Adelbet B，Peter S，Wolfgang W．Process for the production of lipstatin and tetrahydrolipstatin［P］．EP 0 803 576A2，1997－10－29．

［3］Varga I，Gondova B，Gajdosikova J，et al．The strain Streptomyces toxytricini lipstatin－producing microorganism and preparation of lipstatin with inscribed strain［P］．WO 2007 078 263A2，2007－07－12．

［4］Gasparic A，Svageli N B，Raspor P，et al．Fermentative production of lipstatin［P］．EP 1 860 194A1，2007－11－28．

［5］Fujs S，Kuscer E，Petkovic H，et al．Process for production of lipstatin and microorganisms therefore［P］．WO 2010 000 839A1，2010－01－07．

［6］茆永康，陈代杰，黄为一．表面活性剂PEG600对毒三素链霉菌发酵的影响［J］．中国抗生素杂志，2005，30（11）：649－652．