高酒精耐受性产酒酵母菌的选育

姚小飞，吴晓慧，叶 璐

（1．武汉生物工程学院生物工程系，湖北 武汉430415；2．华中农业大学，湖北 武汉430205；3．武汉市汉铁高级中学，湖北 武汉430010）

目前，发酵生产工业酒精的菌种主要以酵母菌为主。酒精是酵母菌厌氧发酵的重要产物，而过多的酒精对酵母菌细胞本身具有毒害作用，会影响细胞膜成分和细胞代谢。因此，酵母菌的产酒精能力与耐酒精能力是密不可分的。Thomas直接以抑制菌株生长时的酒精浓度来表达该菌株的酒精耐受性，并根据不同酒精浓度耐受性将菌株分为3个等级［1］。我国测定酵母菌耐受酒精浓度的方法基本属于此种范畴［2，3］。

作者结合酵母菌产酒精能力的检测，利用鉴别性平板技术更快速地选育优良的高酒精耐受性产酒酵母菌，具有生产实践意义。

1 实验

1．1 样品来源

采集某高粱酿酒厂的大曲酒糟作为实验样品。

1．2 培养基

PDA液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH值自然。

YPD固体培养基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、琼脂2%、蒸馏水，pH值自然。

TTC上层培养基［4］：葡萄糖5g，琼脂15g，TTC 0．5g，蒸馏水1000mL。

TTC下层培养基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母膏1．5g，磷酸二氢钾1．0g，硫酸镁0．4g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 值5．5～5．7。

1．3 方法

1．3．1 产酒酵母菌的分离

取适量样品置于PDA液体培养基（添加12%酒精）中，于28℃下富集培养24h。将培养液进行梯度稀释。分别取10－5、10－6、10－7稀释度的菌悬液各0．1 mL涂布于TTC下层培养基上，于28℃下恒温培养24h后，在其上覆盖一层TTC上层培养基，于28℃保温培养3h，观察显色反应。根据颜色现象选取产酒精能力强的菌株进一步划线纯培养［5］。

1．3．2 产酒酵母菌的酒精发酵能力检测

采用二氧化碳失重法［6，7］测定酵母菌的发酵产酒精能力。利用酒精计测定酵母菌发酵的酒精含量。

1．3．3 产酒酵母菌酒精耐受能力检测

向已经灭菌的YPD固体培养基中加入不同体积的无水酒精，调整体积分数分别为12%、14%、16%、18%、19%、20%，将初筛的菌株分别接种至不同酒精体积分数的平板上，标记静置10min后，于28℃下恒温培养48h。

1．3．4 酵母菌的鉴定

用美蓝对酵母菌进行染色，观察酵母菌个体形态。用测微尺测定酵母菌的大小。观察酵母菌群体在固体培养基和液体培养基中的培养特征。

分别对筛选得到的酵母菌进行氮源同化试验［8，9］、糖发酵试验、淀粉水解试验、脂肪水解试验、尿素酶试验、重氮基蓝B（DBB）试验，对酵母菌进行鉴定。

1．3．5 酵母菌的紫外诱变

参照文献［10］方法进行酵母菌生长曲线的绘制。

分别取生长期的菌液3mL加至9套平皿中，搅拌均匀，在254nm波长下，分别经紫外线照射（垂直距离30cm）10s、20s、30s、40s、80s、120s、160s、200s、240s后，取出1mL处理菌液稀释至10－2，取0．1mL涂于平板上，包扎后置于暗处28℃培养48h。以照射时间为横坐标、致死率为纵坐标绘制酵母菌的生长曲线。

采用致死率为60%～80%的条件进行诱变操作，将诱变后的菌液涂布于含20%、21%、22%酒精的YPD固体培养基平板上，于28℃下恒温培养48～72 h后观察。

2 结果与讨论

2．1 产酒酵母菌的分离

培养液涂布于TTC显色平板后，共筛选出26株具有不同产酒精能力的酵母菌。其中12株呈深红色、9株呈微红色、5株呈粉红色，分别编号后进一步划线分离。

2．2 产酒酵母菌的酒精发酵能力和酒精耐受能力检测

对初筛得到的12株呈深红色的酵母菌菌株分别进行酒精发酵实验，结果如表1所示。

表1 初筛菌株的酒精发酵能力Tab．1 The fermentation ability of the preliminarily－screened strains

由表1可以看出，S5、S9、S13、S15、S16、S17、S24等7株酵母菌的产酒精能力较强，检测这7株酵母菌的酒精耐受能力，结果见表2。

表2 7株酵母菌的酒精耐受性Tab．2 Alcohol tolerance of the seven yeast strains

由表2可知，随着酒精体积分数的增大，酵母菌的生长逐渐受到抑制。比较7株菌株，其中仅有菌株S17可以耐受19%的酒精。因此，将菌株S17作为后续实验的目标菌株。

2．3 菌株S17的鉴定

2．3．1 形态大小观察

菌株S17的个体形态见图1，菌落形态见图2。

由图1可知，S17营养细胞呈圆形或椭圆形，繁殖方式主要为芽殖，细胞大小为（2．1～3．5）μm×（7．1～13）μm。

由图2a可知，菌株S17的菌落为圆形，大小为4．0～5．5mm，边缘整齐，有明显的凸起，菌落呈乳白色，透明度较差，质地光滑较湿润。图2b为TTC显色平板上的划线分离结果。

2．3．2 生理生化试验

菌株S17的氮源同化及糖发酵试验结果分别见表3、表4，其它生化试验结果见表5。

表3 菌株S17对氮源的同化情况Tab．3 The nitrogen assimilation for strain S17

表4 菌株S17对糖类的发酵情况Tab．4The carbohydrate fermentation for strain S17

表5 菌株S17的其它生理生化指标Tab．5 The physiological and biochemical characters identification of strain S17

综合上述形态观察和生理生化试验结果，参照《酵母菌的特征与鉴定手册》，初步确定S17属于酒香酵母属（Brettanomyces）。

2．4 菌株S17的紫外诱变

2．4．1 菌株S17的生长曲线

以培养时间为横坐标、OD600值为纵坐标，绘制菌株S17的生长曲线，结果如图3所示。

图3 菌株S17的生长曲线Fig．3 The growth curve of strain S17

由图3可知，菌株S17培养至18～20h即到达稳定期。因此，选择培养20h的酵母菌细胞作为最佳出发菌种。

2．4．2 菌株S17的致死曲线

经平板菌落计数，计算出紫外线照射不同时间的致死率，结果如图4所示。

图4 菌株S17的致死曲线Fig．4 The mortality curve of strain S17

由图4可知，随着紫外线照射时间的延长，菌株S17的致死率呈上升的趋势。照射时间为120s时，致死率就达到了82%；照射时间为160s时，致死率达到90%。因此，选择最佳紫外线照射时间为120s。

2．4．3 正突变株的筛选

将生长期酵母菌悬液经紫外线照射120s后，适当稀释涂布于含20%、21%、22%酒精的YPD固体培养基平板上进行筛选，结果在含20%酒精的平板上筛选出一株正突变株，标记为酵母菌S－T－01。

3 结论

从某高粱酿酒厂的酒糟中，通过TTC平板显色实验，共筛选到26株具有产酒精能力酵母菌。对26株酵母菌分别进行酒精发酵能力和酒精耐受能力检测，最终获得一株耐受19%酒精的酵母菌株，编号为S17。对菌株S17进行形态观察及生理生化试验，鉴定菌株S17属于酒香酵母属（Brettanomyces）。对菌株S17进行紫外诱变以提升其耐酒精的能力。结果表明，菌株S17经紫外线照射120s，筛选到一株可以耐受20%酒精的正突变株，相比原始菌株的酒精耐受力提高了1%。

［1］苏艳秋，朱卫华，吴鹏，等．耐高温、耐高酸产酒精酵母的筛选与鉴定［J］．微生物学杂志，2009，29（2）：43－47．

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