浅析淋巴细胞亚群功能检测技术

郑金波

珲春矿业（集团）有限责任公司总医院，吉林珲春 133300

单独测定淋巴细胞或其亚群的数量，常常不能反映淋巴细胞的功能。淋巴细胞功能试验则是检查淋巴细胞（或某种亚群）在特异抗原刺激作用下分泌某种细胞因子或抗体（I g）的能力。检测方法有以下几种。

1 酶联免疫斑点（Euspot）法

用针对细胞因子如IFN、TNF、白细胞介素或免疫球蛋白的单克隆抗体包被Millipore Multiscreen 96孔滤膜板，加入待测PBMC（或纯化的淋巴细胞亚群）及待研究的特异性抗原多肽共同温育，当PBMC（或纯化的淋巴细胞亚群）中有能特异识别抗原多肽的细胞时，这些细胞即可分泌某种细胞因子或某类I g。包被在膜上的单抗可捕获相应的细胞因子或I g。最后再加入酶标记的抗相应细胞因子或I g的抗体反应，洗板后加入酶底物／色原呈色。以测定淋巴细胞分泌IFN-Y为例，简述如下。

①抗人IFN-Y单克隆抗体（1 mg／mL）5 μL加10 mL pH7.4的无菌0.01 mol／LPBS，包被Millipore Multiscreen 96孔滤膜板，每100 μL，4℃过夜，用含热灭活1%胎牛血清的PBS洗板，每孔加洗液200 μL，加入孔中吹吸后吸出，洗板6次。

②分别于每孔中加入含10%胎牛血清的RPMIl640培养液30 μL，待研究的抗原肽10 μL和待测细胞100μL[（1～3）×106／mL。同时设阴性对照（含10%胎牛血清的RPMIl640培养液）和阳性对照（加10 μL浓度为10 μL／mi的植物血凝素），于37℃ 5%CO2温箱过夜。用PBS洗板6次。

③取出生物素化的抗人IFN-Y抗体加入10 μL无菌PBS中，振荡混匀，每孔加入该溶液100 μL。于室温（18～25℃）温育1 h。用PBS洗板6次，拍干。

④取5 μL酶（ALP）标记的链霉亲合素，加入10 mL无菌PBS中振荡混匀，每孔加入该溶液100 μL。于室温温育1 h。用PBS洗板6次，拍干。

⑤取10 μL Tris缓冲液（pH 9.5），依序分别加上述NBT和BCIP显色试剂储存液各L00 μL，振荡混匀即为酶底物应用液。取该溶液加入96孔滤膜板中，l00 μL／孔。置室温温育15～20 min，至出现黑色斑点弃去板中液体。

⑥每孔加入0.05%Tween20的PBS200 μL。置室温10 min，终止显色反应。弃去孔中液体，用流水冲洗3次，室温晾干后，用ELlspot读板仪读取数据。

根据斑点形成的多少和大小判定淋巴细胞分泌细胞因子（如IFN-Y）或I g的功能。每一个着色斑点代表一个独立细胞分泌细胞因子（如IFN-Y）的情况，斑点的数目代表抗原特异性淋巴细胞的数量，斑点的大小和染色程度则反映淋巴细胞分泌细胞因子或I g的水平。

2 T淋巴细胞功能测定技术

2.1 T淋巴细胞转化试验

在体外培养的条件下，人类T细胞通过特定抗原（结核菌素）或非特定的有丝分裂原，如植物血凝素（PHA）后会发生刺激淋巴细胞增殖和成。3 h -胸腺嘧啶的参与可能发生淋巴细胞转化试验测定。细胞免疫功能低下者,T淋巴细胞转化率降低。刀豆蛋白A（ConA）是小鼠T细胞的马仁特异性有丝分裂原。

2.2 混合淋巴细胞培养

器官移植前应先受体和供体淋巴细胞混合淋巴细胞培养实验来选择一个合适的捐赠者。方法和单向法双向混合淋巴细胞培养点。双向法两个人一起混合淋巴细胞培养,如果不同HLA分子，两个来源的淋巴细胞刺激将被改造。根据程度的转换来确定两个人不同程度的淋巴细胞HLA分子。同卵双胞胎之间的混合淋巴细胞培养后不发生转换。单向法将单个淋巴细胞治疗与丝裂霉素或辐射失去自己的能力，但一直有着这样的抗原性，淋巴细胞淋巴细胞混合培养，未经处理的另一个个体。根据程度的淋巴细胞转化治疗来确定两个人淋巴细胞HLA分子不同的程度。混合淋巴细胞培养实验中，T淋巴细胞和B淋巴细胞转化均可发生。

2.3 延迟超敏反应皮肤试验

已知数量的抗原（如结核菌纯蛋白衍生物）注入到前臂皮肤，24～48 h后测定硬化＞硬结尺寸，直径10 mm，被认为是阳性的。皮肤测试负可能有细胞免疫功能低下，不能接触与相应的抗原。

2.4 细胞介导的细胞毒性试验

用效应性CTI和51cr标记的靶细胞相互作用。被杀死靶细胞可以释放51cr、确定目标细胞的放射性释放51cr、可以确定效应细胞的细胞毒作用的影响的CTL。使用类似的方法还可以确定细胞毒性NK细胞活性。

3 B淋巴细胞功能检测

①B淋巴细胞转化试验的淋巴细胞和不溶性金黄色葡萄球菌（B淋巴细胞分裂原），连同3 h -胸腺嘧啶参与实验可以测定B淋巴细胞转换发生。细菌脂多糖在小鼠B细咆分裂原。

②测定抗体生成细胞常用的溶血空斑试验。在这个实验中，抗体生成细胞分泌I g与绵羊红细胞（生成）表面的抗原，补充溶血性反应参与。方法是吸附有已知的抗原生成，等待检验的B淋巴细胞，补充和琼主旨糖的混合物，倾注平皿和1～3 h后，驱散肉眼可见的溶血牙菌斑和每个空点中央含有抗体形成细胞的数量、斑块是抗体形成细胞数。是NK细胞功能的检测。

目前国内外多采用检测NK细胞活性来研究不同疾病状态下NK细胞的杀伤功能。体外NK细胞活性测定的方法较多，常用的有流式细胞术、形态学方法、放射性同位素释放法、酶释放法、特异性荧光染料释放法等。本节仅介绍流式细胞仪测定NK细胞功能。

NK细胞活性是一种细胞介导的细胞毒作用，它无须特异性抗体参与，也无MHC限制性，不经抗原活化即能直接杀伤靶细胞。实验选用K562细胞为测定人NK细胞活性的靶细胞，利用碘化丙啶染料排斥法，这种染料具有只渗透到死亡细胞内的特点，用流式细胞仪检测靶细胞受NK细胞作用后的死亡率来反映NK细胞的活性。

①肝素抗凝血2 mL，如等量生理盐水稀释后，用淋巴细胞分离液按常规法分离出淋巴细胞。

②用0.01 mol／LpH7.4PBS洗涤分离的淋巴细胞2次，每次1000 r／min，离心5 min。计数细胞数，作为效应细胞。

③取培养于含10%小牛血清的RPMll640培养液中处于指数生长期的K562靶细胞，用上述培养液洗涤2次、计数、备用。

④按效应细胞（淋巴细胞）：靶细胞为20：1的比例取细胞混匀于200 μL 10%小牛血清的RPMI l640培养液中。另设单纯K562细胞自然死亡对照组，低速离心000r／min，1 min后，置37℃温箱，作用2 h，置4℃冰箱，加入碘化丙碇（pI，501μg／mL）1 mL到上述试管中，1～2 h上流式细胞测定NK细胞活性。

⑤流式细胞仪测定：按仪器操作说明书进行，以PI染每。的K562细胞为死细胞，NK细胞活性则以靶细胞死亡率为指标。

检测T、B和NK细胞主要是用免疫学技术测定它们的表面标志物，如T细胞主要测定细胞膜上的分化抗原群（cluster of differentiation，CD）CD3、CD4、CD8。其中，CD3是所有T细胞的特有标志，CD4是辅助性T细胞（TH）的标志，CD8是细胞毒性T细胞（Tc）的标志。B细胞的表面标志主要是膜免疫球蛋白或表面免疫球蛋白IgM、IgD以及CD抗原CDl9、CD20、CD22。NK细胞特异表面标志主要为CD56和CDl6。

[1] 黄晓群.联合检测外周血T淋巴细胞亚群及血清CEA在大肠癌患者中的表达意义[J].检验医学与临床，2009，6（12）：996.

[2] 王立芳，许惠玉，张威.免疫荧光技术和免疫酶标法在T淋巴细胞亚群检测中的应用体会[J].齐齐哈尔医学院学报，2004，25（3）：292.