免疫亲和柱的制备及在真菌毒素检测中应用的研究进展

袁 艺，陆廷瑾，沈腾腾，秦学磊，刘 莹，焦志培，廖惊殊，张东升，*

（1.江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡214013；2.河南省粮油饲料产品质量监督检验中心，河南郑州450003；3.湖南中储粮质量检测中心，湖南宁乡410600）

真菌毒素是真菌的次生代谢产物，它会引起人和动物的急性和慢性中毒[1]。产生真菌毒素的真菌属有黄曲霉属、镰刀菌属和青霉菌属等。其中对人类危害最大、研究最多的真菌毒素有：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇。许多作物在生长、收割、干燥和贮藏期间已经被真菌毒素所污染。谷物、坚果、乳制品和棉籽等都比较容易被真菌毒素污染[2]。调查研究表明全球至少100个国家均存在食品被毒素污染的情况，大多数都是被黄曲霉毒素所污染，不同国家的限定标准也不一样[3]。

常见的分析检测真菌毒素的方法包括薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、质谱分析（MS）和酶联免疫吸附法（ELISA）等。TLC法由于设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用，但该法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，在展开时影响斑点的荧光强度。而双向展开虽避免了杂质干扰，但增加了操作步骤和时间[4]。ELISA方法简便快捷，但是由于提取处理不净，基质中杂质干扰，容易出现假阳性。

近几年来，免疫亲和层析柱已被广泛应用于真菌毒素的净化处理[5]。免疫亲和柱净化处理方法可选择性地将真菌毒素从提取液中分离出来，提高了荧光分析的灵敏性，降低检测限[2]。与其他提取方法比较，免疫亲和柱的前处理净化技术还有其他优势。主要表现：a.提取时避免使用有毒有机溶剂，减少对操作人员的损害；b.方便快捷，简化了前处理步骤；c.由于净化处理彻底，减少了基质中的杂质干扰，数据更加可靠。本文对免疫亲和柱的原理和制备方式进行了介绍，并且针对几种常见的真菌毒素，综述了免疫亲和柱净化技术在这几种真菌毒素检测分析上的应用。

1 免疫亲和柱原理

向亲和柱空柱管内装0.2～0.5m L凝胶，其中分析物的抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）已经固定在凝胶上。先用PBS缓冲液冲洗柱子，使样品粗提液缓慢通过柱子，控制流速1～2m L/m in。提取液随着重力或者注射器推动下，缓慢流出亲和柱，再用PBS冲洗去除填料上的杂质，最后通过破坏抗原抗体之间的键，目标物从柱子上被洗脱下来。对于小分子来说，可以用少量的甲醇或者乙腈来完成。洗脱大分子需要酸性条件[6]。也可以用含有NaCl的甘氨酸缓冲液洗脱分析物[7-8]，这样会减小对抗体的破坏。

值得注意的是样品提取液一般是水溶性的，有机溶剂会破坏抗体，干扰抗原抗体相互作用。抗体特异性、抗原结合强度（动态结合能力）、抗体的位点总数，均会对回收率产生影响。样品提取的体积也是限定因素，净化大体积的提取液可能产生较长的操作时间。对于液体样品，比如说牛奶，啤酒，葡萄酒，醋还有酱油，可以直接通过免疫亲和柱，而不需要前处理提取。

2 免疫亲和柱制备方式

目前制备免疫亲和柱通常是选用一种载体，将IgG抗体与载体偶联，制备成相应的免疫亲和柱。亲和介质的制备过程涉及载体的选择、空白介质活化、配基偶联、封闭未偶联位点，以及清洗保存等步骤，其中介质活化及配基偶联过程是影响介质性能的关键。亲和柱载体的选择有多种，常用的载体有琼脂糖凝胶、纤维素以及一些合成的有机基体（如聚丙烯酰胺凝胶和聚乙烯凝胶等）。为了使基体更适于HPLC分析，人们正积极研发新型的基体材料。这类基体主要有硅胶、玻璃及某些有机物的衍生物。该类基体的高效能和机械稳定性使其用于HPLC系统时，提高了分析的速度和精密度[9]。

基质活化通常在骨架上引入强亲电基团，然后与抗体上亲核基团如-NH2、-OH、-SH等发生取代反应，使抗体连接于基质上[10]。常用的介质活化方式包括环氧活化、溴化氰活化以及戊二醛活化等，溴化氰活化的琼脂糖是通常选用的亲和柱载体材料[11]。孙兴荣等[12]应用溴化氰激活的Sepharose 4B，制备了黄曲霉毒素M 1污染样品的净化前处理免疫亲和柱，装柱后通过ELISA对免疫亲和柱的性能评价确立了最佳反应条件，平均回收率为92.46%，变异系数2.3%～7.2%。张灿等[13]以硅胶作为载体制备的氯霉素免疫亲和柱对氯霉素抗体的偶联率达到72%，能有效的对样品中痕量残留的氯霉素进行纯化富集，硅胶相比于琼脂糖凝胶，性价比高，耐压性较强，是一种良好的免疫亲和柱载体。

抗体与活化基体的偶联方式有随机偶联与定向偶联两种，随机偶联时，基体与抗体的结合位点不固定，这是因为随机偶联时，抗体的抗原结合位点可能被占用，或者挤占了抗原结合位点的空间结构，导致与抗体失去亲合力。因此，随机偶联后的IAC免疫活性一般较低。定向偶联是先将protein A或protein G固定在基体上，protein A或protein G只与IgG的Fc区相结合，然后用二甲基庚二酸酯等化学交联剂使抗体（多抗或单抗）与protein A或protein G定向偶联，抗体上的抗原结合位点则处于游离状态[9]。黄昕等[14]的实验研究表明使用protein A的定向偶联抗原结合容量是随机偶联的1.8倍，说明定向偶联有助于提高免疫亲和吸附剂的抗原结合容量。

3 免疫亲和柱在真菌毒素检测分析前处理上的应用

3.1 黄曲霉毒素

黄曲霉毒素在食品和饲料上的污染问题已经成为近30年人们广泛关注的问题。该毒素是一组由黄曲霉属真菌在作物生长期间产生的有毒代谢产物。当温度和湿度条件适宜，这些真菌就能在食品和动物饲料中生长。黄曲霉毒素对人类和动物都有很大的危害，可以导致癌变、畸形和突变。

选用适宜的方法测定食品中的黄曲霉毒素已经逐渐成为研究的热点问题。Ardic等[5]采用免疫亲和柱与ELISA结合的方法测定土耳其市场上75个胡椒粉样品，其中72个样品中黄曲霉B1的范围在0.11～24.7μg/kg之间，11个高于国家黄曲霉限量标准。杨小丽等[15]测定动物类药材中黄曲霉毒素时，样品经过甲醇-水提取后，通过免疫亲和柱净化，柱后光化学衍生，HPLC-荧光检测器测定后发现，回收率为78.8%～106.7%。这种方法灵敏度高、重现性好，适合动物药材中黄曲霉毒素的快速定量分析。2003年由国家质量监督检验检疫总局发布并实施的《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》（GB/T 18979-2003），首次将免疫亲和层析柱作为净化黄曲霉毒素的标准方法[16]。2010年由中华人民共和国卫生部发布并实施的《乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定》，要求将免疫亲和层析柱净化作为LC-MS、LC、荧光分光度法的前处理手段[17]。

3.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素（OTA）是一种由曲霉属真菌和青霉属真菌在不同环境条件下产生的一种真菌毒素。OTA可以存在于不同的产品中，比如说谷物、调料、咖啡、牛奶、啤酒以及一些猪的血液和肾脏中，可引起动物的肾脏肝脏肿瘤等疾病[18-23]。

其测定方法也有多种，如基于反相柱的HPLC方法，离子迁移色谱[24]，荧光检测方法，HPLC和质谱联用等方法[25]。大多数方法都是利用固相柱净化提取和亲和层析技术去除杂质，可避免测定毒素时杂质的干扰。

免疫亲和柱与LC-MS可以联合用于测定咖啡饮料中OTA的含量。Noba等[26]用免疫亲和柱前处理净化提取，LC-MS确定OTA含量，加标量为0.1ng/m L，回收率为97.3%，RSD为1.9%，同时抽检日本市场上30个咖啡饮料样品用此种方法分析，OTA含量从0.002ng/mAL到0.037ng/m L，此方法目前已被证明可以准确的用于测定咖啡饮料中的OTA含量。酒日渐成为各个国家消耗量最大的一种常用食品，也是容易被OTA污染的主要食品之一。测定酒中OTA的方法无疑都要用到有毒试剂来提取，步骤繁琐。Visconti等[27]使用免疫亲和柱净化和HPLC-荧光法确定酒中赭曲霉毒素的含量，白酒、红酒样品中的OTA水平从0.04到10ng/m L，平均回收率为88%～103%。由于免疫亲和柱是基于抗体的特异性净化提取，所以实验方便分析，节省时间。2009年由国家质量监督检验检疫总局及标委会发布并实施的《食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》（GB/T 23502-2009），将免疫亲和层析柱作为净化赭曲霉毒素A的标准方法[28]。

3.3 伏马毒素

伏马毒素（FB）是一组主要由串珠镰刀菌在一定温度和湿度条件下繁殖产生的真菌毒素。它是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，其中FB1、FB2是主要组分，在世界范围内均被发现，主要存在于玉米中，能够对玉米及其制品造成污染。

伏马毒素的检测方法有HPLC法、TLC和ELISA等。随着免疫亲和柱净化方法在黄曲霉毒素检测上被广泛应用，一些研究者在测定食品中的伏马毒素时也采用免疫亲和柱净化与HPLC、TLC联用的检测手段，发现其检测灵敏，避免了杂质干扰。Girolamo等[29]采用免疫亲和柱与HPLC联用的方法测定婴儿玉米食品中的伏马毒素B1与B2，在55℃萃取，免疫亲和柱净化，HPLC检测，样品加标浓度为80～800μg/kg FB1和20～200μg/kg FB2，平均回收率范围FB1从83%到97%，FB2范围从61%到78%，检测限为FB12.8μg/kg，FB22.2μg/kg。2010年由国家质量监督检验检疫总局及标委会发布并实施的《粮油检验玉米及其制品中伏马毒素含量测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》（GB/T 25228-2010），将免疫亲和层析柱作为净化伏马毒素的标准方法[30]。

3.4 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种由镰刀菌属产生的广泛分布的真菌毒素，是导致谷物疾病的主要因素。该毒素主要存在于玉米中，但是发现其也会存在于小麦、大麦和高粱中。

目前分析检测玉米赤霉烯酮方法包括薄层层析法[31]，GC-MS分析[32]和HPLC[33]等，尽管这几种方法检测限低，但是它们耗时，使用溶剂量大，这时就需要一种或多种净化处理步骤。

Trucksess等[34]用HPLC-与免疫亲和柱净化检测日常食用的大豆、谷物和谷物产品中的玉米赤霉烯酮的含量，样品用75%甲醇-水提取，离心，用免疫亲和柱净化，接着用HPLC-荧光测定，样品中ZEN含量小于10mg/kg，对于所有的实验样本，同批次间的回收率从82%～88%，不同批次间的从81%～84%。使用这种免疫亲和柱净化可使HPLC检测更灵敏，更快速和简便。2009年由国家质量监督检验检疫总局及标委会发布并实施的《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》（GB/T 18979-2003），将免疫亲和层析柱作为净化玉米赤霉烯酮的标准方法[35]。

3.5 脱氧雪腐镰刀烯醇

脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）是谷物中最常见的单端孢霉烯化合物，主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生。这些真菌会在农作物中生长，比如说玉米、小麦、大麦、燕麦和黑小麦。DON对人类和动物都有害，会诱发多种疾病，使神经信号改变，破坏激素轴，使肠道发生病变[36]。动物吃过被DON污染的饲料后会引起呕吐和腹泻。长期接触DON也会导致生长迟缓，激发或者抑制免疫系统[37]。

随着饲料和食物中DON浓度的限量，一些高效确定DON的分析方法逐渐发展起来。目前有多种方法可以确定复杂基质中的DON含量，如酶联免疫吸附、荧光偏振免疫分析，还有一些层析的方法，比如说薄层层析、气相层析或者是质谱分析、HPLC-紫外检测、柱后衍生-荧光检测。尽管使用了一些选择性分离和灵敏的检测方法，但是还只在预处理步骤之后才能检测出食品和饲料中的DON。现在炭/氧化铝柱和免疫亲和柱是最常用的净化提取方法。2009年由国家质量监督检验检疫总局及标委会发布并实施的《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》（GB/T 23503-2009），将免疫亲和层析柱作为净化脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准方法[38]。

Li等[39]采用免疫亲和柱和超高液相色谱串联质谱法确定谷类食品中是否含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇。他采用抗DON单克隆抗体制备的免疫亲和柱来净化处理，然后用超高液相色谱串联质谱分析谷物中的DON含量。这种免疫亲和净化方法对DON有较高的回收率。小麦、大米的回收率从61%～103%。柱容量是每毫升凝胶2.86μg DON，在间隔两天10次循环使用后柱容量仍然可以高于0.68μg/m L DON。

4 存在问题和现状

真菌毒素检测前处理最有效的方式是通过免疫亲和吸附作用特异性地将毒素分子从待检样品的复杂组分中分离出来。但是还存在一些的问题，主要表现在以下4方面：

4.1 价格高

我国用于食品真菌毒素检测前预处理产品多依赖于进口，每支柱的价格在150元左右。早在上世纪80年代，国外已经实现了真菌毒素免疫亲和层析柱产业化，产品几乎覆盖了所有真菌毒素的检测前处理，主要的品牌有德国的r-拜发、美国VICAM、美国becon。国内真菌毒素特异性单克隆抗体的规模制备和抗体分子与层析介质偶联形成各式真菌毒素免疫亲和层析产品是决定真菌毒素检测前处理产品能否规模化生产的决定因素。

4.2 抗体特异性

国际上，已实现真菌毒素特异性单克隆抗体的规模制备，但单克隆抗体对毒素分子的特异性还具有提升空间，而国内多通过动物直接免疫获得的抗体产品，抗体产量低、特异性差、产品不稳定。

4.3 重现性

国际国内多采用直接偶联的方式将抗体分子无序的固定在活化的层析介质上，造成抗体亲和介质对毒素分子的吸附量低，抗体分子被低效利用，并造成一定程度的非特异性吸附，从而使批间产品之间存在较大的差异。

4.4 稳定性

首先由于抗原与抗体的结合受温度影响较大，其次试样流过亲和柱的流速直接影响抗体对毒素分子的捕获，再有很多厂家很少公布自己产品的柱容量，导致客户使用时，有时因上样浓度大而导致实验失败。

5 展望

真菌毒素在谷物饲料中的污染已经逐渐被人类所重视，其检测手段日渐趋于成熟。免疫亲和柱前处理净化技术在测定食品中真菌毒素含量方面起到不可替代的作用，大多数方法都是样品提取后使用免疫亲和柱净化，基于HPLC的检测。Ham ide Z Senyuvaa[40]曾报道该净化方法已经用于兽药残留，杀虫剂残留、环境污染和维生素检测方面。相信随着免疫亲和柱的不断发展，其会运用到更广泛的领域。

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