红三叶异黄酮对低温诱发肉鸡腹水综合症发生和抗氧化性能的影响

姜义宝，杨玉荣，冯长松，王成章，崔国文

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州450002；2.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨150030）

肉鸡腹水综合症（ascites syndrome，AS）又称肉鸡肺动脉高压综合症（pulmonary hypertension syndrome，PHS），是一种由多种致病因子引起的非传染性疾病，以右心肥大－腹水形成为特征的主要发生于商品代肉仔鸡的一种综合症侯群。近年来该病的发生率呈上升趋势，成为困扰肉鸡养殖业的严重疾病之一，造成巨大的损失。肉鸡AS的原发性因素是缺氧性肺动脉高压，一些学者研究认为自由基的介导机制可能是肉鸡AS发生的病因。快速生长的肉鸡对氧的大量需要，机体供氧不足导致组织细胞产生大量的氧自由基，消耗体内的抗氧化物质，引起AS患鸡体内抗氧化防御体系功能降低，使生物膜脂质过氧化和DNA变异，将损伤细胞的结构和功能，缺氧条件下自由基促发血管收缩、重构和血栓形成，肺动脉压升高，导致AS的发生［1，2］。现代医学表明，氧自由基的增多以及清除自由基的物质减少或活性降低，在肺动脉高压等血管性疾病的发生发展过程中起着重要作用［3］。肉鸡饲养过程中添加抗氧剂，能够减轻自由基对机体的损伤，有效的预防和治疗AS。补硒和添加Ve可明显地减缓脂质过氧化反应，降低AS的死亡率［4］。齐永华和王文魁［5］在饮水中添加中药口服液，发现能明显降低冷刺激条件下肉鸡心肌组织的损伤，增强机体抗氧化能力，提高机体抗冷应激和耐缺氧能力，明显降低AS的发生。

红三叶（Trifolium pratense）为豆科三叶草属的多年生草本植物，南北均有种植，资源丰富，是集草、药兼用于一体的优良植物，具有广阔的应用和开发价值［6］。红三叶异黄酮是红三叶草中重要活性物质，属于4′－甲氧基类异黄酮，主要含有4种异黄酮，即芒柄花素（Formononetin）、鹰嘴豆芽素A（Biochanin A）、大豆黄素（Daidzein）、染料木素（Genistein）［7］。流行病学研究表明，红三叶异黄酮具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑制细胞增殖和促进凋亡等作用［8，9］，适量应用可以降低心血管疾病的发生概率，其中抗氧化和抑制细胞增殖、促进凋亡备受关注。红三叶异黄酮对血红蛋白－过氧化氢、黄嘌呤氧化酶诱导的脂质过氧化反应有明显抑制作用，还能保护大脑神经元细胞，有效消除紫外线引起的DNA损伤，被认为是有效的抗氧化剂和自由基清除剂［10］。红三叶异黄酮在肉鸡上应用具有提高其生长速度、改善肉质的作用［11］，但对AS的影响国内外未见报道。本研究在肉鸡饲料中添加红三叶异黄酮，分析低温下对AS和抗氧化性能的影响，为AS的预防和治疗提供一种新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验动物和设计

2009年1月购买300羽1日龄AA雄性肉仔鸡，正常饲养至10日龄，随机分成对照组（Ⅰ）、低温组（Ⅱ）和低温黄酮组（Ⅲ），每组6个重复，每个重复15只。Ⅰ组为常温饲养，温度在（24±2）℃，Ⅱ和Ⅲ组低温饲养，温度为（12±2）℃，Ⅰ和Ⅱ组饲喂基础日粮，Ⅲ组饲喂基础日粮＋红三叶异黄酮（20mg／kg），红三叶异黄酮购于湖南现代九汇有限公司，总黄酮含量80.64%。鸡采用笼养，自由采食和饮水，第7天进行新城疫和传支二联苗免疫。

1.2 心脏指数的测定

分别于14，21，28，35，42日龄每组随机取6只鸡，取出心脏，清除脂肪组织和心腔内瘀血凝块，沿冠状沟剪去心房，称取全心室（TV）重量，再沿前后纵沟剪下右心室（RV）称重，最后计算RV质量／TV质量×100%，此为心脏指数（ascites heart index，AHI）。

1.3 红细胞压积的测定

红细胞压积（packed cell volume，PCV）采用温氏法，用肝素钠作为抗凝剂，采静脉血2mL注入试管中，用细长的毛细滴管吸取抗凝血，防止气泡的产生，缓缓注入温氏管到刻度100mm处，以3 000r／min的速度离心30 min，读取红细胞层的高度，然后再离心10min至红细胞不再下沉为止，此为PCV值。

1.4 各组肉鸡PHS发生率的统计

肉鸡进行解剖，在临床上各器官表现异常，有发生腹水的肉鸡典型特征，其中以肉鸡腹腔积液大于10mL为腹水发生的判定标准之一；并测定所有肉鸡的AHI，AHI＞0.25作为腹水发生的判定的另一标准，二者同时具备作为AS最后判定标准。

1.5 抗氧化性能的测定

肉鸡采血分离血清，同时采肝脏组织，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）测定所用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，所用的测定方法均按照操作说明进行。

1.6 统计与分析

采用Excel 2003处理数据和DPS 7.05软件进行数据统计分析，采用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.01（差异极显著）或P＜0.05（差异显著）为显著性标准，试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 红三叶异黄酮对肉鸡AHI的影响

肉鸡饲喂红三叶异黄酮能够减轻AHI，随着饲养时间的延长，Ⅲ组AHI逐渐增大，但低于Ⅱ组（表1）。在第14和22天，Ⅲ组AHI高于Ⅰ组，低于Ⅱ组，各组间差异不显著（P＞0.05），在第28和35天 Ⅲ组和Ⅰ组均显著低于Ⅱ组（P＜0.05或0.01），42dⅢ组和Ⅰ组低于Ⅱ组，并且各组间无明显差异（P＞0.05）。

2.2 红三叶异黄酮对肉鸡PCV的影响

肉鸡PCV在第14天，各组间无明显差异（P＞0.05），在第21和28天Ⅰ组低于Ⅱ组和Ⅲ组，并且显著低于Ⅱ组（P＜0.05），Ⅲ组低于Ⅱ组但无明显差异（P＞0.05），在35d，Ⅲ组和Ⅰ组均极显著低于Ⅱ组（P＜0.01），在第42天Ⅰ组显著低于Ⅱ组与Ⅲ组（P＜0.05），表明红三叶异黄酮能够降低肉鸡PCV（表2）。

表1 红三叶异黄酮对肉鸡右心肥大指数的影响Table 1 Effect of red clover isoflavones on ascites heart index（AHI）of broilers

表2 红三叶异黄酮对肉鸡红细胞压积的影响Table 2 Effect of red clover isoflavones on packed cell volume（PCV）of broilers %

2.3 红三叶异黄酮对低温肉鸡AS发生率的影响

Ⅰ组在试验期间肉鸡腹水发生率为1%，Ⅱ组为15%，Ⅲ组为4%，低温组AS发病率分别比Ⅰ组和Ⅱ组高14.00和2.75倍，表明红三叶异黄酮能够明显降低AS的发生率（表3）。

2.4 红三叶异黄酮对肉鸡SOD含量的影响

肉鸡日粮加入红三叶异黄酮，血清SOD呈先增高后降低的变化（表4），肉鸡生长第14和21天，Ⅲ组和Ⅰ组血清SOD含量显著低于Ⅱ组（P＜0.05），28～35dⅢ组和Ⅰ组显著高于Ⅱ组（P＜0.05或0.01），第42天Ⅰ组显著高于Ⅱ组（P＜0.05），Ⅲ组高于Ⅱ组但无明显差异（P＞0.05）。

肉鸡日粮加入红三叶异黄酮，肝脏SOD呈先增高后降低的变化，第14和21天，Ⅰ肝脏SOD含量显著低于Ⅱ组（P＜0.05），Ⅲ组低于Ⅱ组，但差异不显著（P＞0.05），第28和35天Ⅲ组和Ⅰ组显著高于Ⅱ组（P＜0.05），42dⅢ组和Ⅰ组高于Ⅱ组但无明显差异（P＞0.05）。

表3 红三叶异黄酮对AS发生率的影响Table 3 Effect of red clover isoflavones on ascites syndrome incidence of broilers %

表4 红三叶异黄酮对肉鸡血清和肝脏SOD含量的影响Table 4 Effect of red clover isoflavones on the content of SOD in serum and liver of broilers U／mL

2.5 红三叶异黄酮对肉鸡GSH－Px含量的影响

肉鸡日粮加入红三叶异黄酮，血清GSH－Px呈逐渐降低的变化（表5），生长第14天Ⅲ组和Ⅰ组血清GSHPx含量高于Ⅱ组，并且Ⅰ组显著高于Ⅱ组（P＜0.05），21dⅢ组和Ⅰ组高于Ⅱ组，但无明显差异（P＞0.05），28～42dⅢ组和Ⅰ组显著高于Ⅱ组（P＜0.05或0.01）。

肉鸡日粮加入红三叶异黄酮，肝脏GSH－Px呈逐渐降低的变化，肉鸡生长第14和21天Ⅲ组和Ⅰ组肝脏GSH－Px含量无明显差异（P＞0.05），28，35，42dⅢ组和Ⅰ组显著高于Ⅱ组（P＜0.05或0.01）。

2.6 红三叶异黄酮对肉鸡MDA含量的影响

肉鸡日粮加入红三叶异黄酮，血清中MDA含量呈增高的变化趋势（表6），在肉鸡生长第14和21天，Ⅲ组和Ⅰ组血清MDA含量低于Ⅱ组，并且Ⅰ组显著低于Ⅱ组（P＜0.05或0.01），28～42dⅢ组和Ⅰ组显著低于Ⅱ组（P＜0.05或0.01）。

肉鸡日粮加入红三叶异黄酮，肝脏中MDA含量呈增高的变化趋势，肉鸡生长第14天，Ⅲ组和Ⅰ组肝脏MDA含量低于Ⅱ组，并且Ⅰ显著低于Ⅱ组（P＜0.05），21～42dⅢ组和Ⅰ组显著低于Ⅱ组（P＜0.05或0.01），在35，42dⅢ组MDA含量显著高于Ⅰ组（P＜0.05），其他组之间无明显差异。

表5 红三叶异黄酮对肉鸡血清和肝脏GSH－Px含量的影响Table 5 Effect of red clover isoflavones on the content of GSH－Px in serum and liver of broilers U／mL

表6 红三叶异黄酮对肉鸡血清和肝脏MDA含量的影响Table 6 Effect of red clover isoflavones on the content of MDA in serum and liver of broilers nmol／mL

3 讨论

低温条件下肉鸡的新陈代谢加强，对氧的需要量明显增加，心脏增加肺部的血流量输出，血流量的增加导致肺部血管网对血流的阻力增加，形成肺动脉高压，肺动脉压的升高使右心室后负荷增加，导致右心功能和结构代偿，出现右心肥大，导致心衰［12］，最终形成AS。研究表明肉鸡AS发生发展过程中血容量增加、红细胞变形性降低、血液黏度升高等都与肺动脉压升高密切相关［13，14］。本试验中加入红车轴异黄酮，可明显抑制PCV和AHI，降低环境低温下AS发病率。李晓莉等［15］给慢性缺氧大鼠饲喂染料木黄酮可以预防右心室肥大发生，降低AHI。红三叶异黄酮作为植物雌激素，改善血管的柔顺性，调节血管细胞因子和生长因子的合成与释放，扩张血管、增加血管容积改变量，这使得肺动脉压降低，右心负担减轻，防止右心肥大，红细胞增生亦受到一定程度的抑制，血液粘稠度降低，减少了环境低温下肉鸡AS的发生。缺氧可增加细胞内Ca2＋水平，酪氨酸激酶途径被激活，植物雌激素为酪氨酸激酶抑制剂，可抑制Ca2＋流入和血管收缩，降低肺动脉高压。

肉鸡绝对缺氧（如高海拔）和相对缺氧（寒冷和快速增重时需氧量增加）时，使机体组织氧自由基的产生和脂质过氧化增加，生理水平的活性氧，具有抗炎、抵御外来病原体的入侵等作用，对于维持血管正常功能具有积极意义［16］。病理条件下，机体内活性氧的积聚过多，则会引起氧化应激反应，对组织和细胞直接造成氧化损伤和（或）启动氧化还原信号途径，促进肺动脉平滑肌细胞增殖，血管内皮细胞损伤，不能够合成、释放血管内皮衍生舒张因子等活性物质，抑制前列环素（PGI2）合成酶，激活血栓素合成酶，使血栓素A2（TXA2）大量生成，破坏PGI2／TXA2平衡，引起血小板聚集并释放活性因子，导致血栓形成，血流阻力加大和内膜增生，血管舒张受阻，形成肺动脉高压［17］。Enkvetchakul等［2］和杨四军等［18］认为不良条件下肉鸡发生腹水综合症时，组织中线粒体内源性氧自由基增多，在亚细胞水平上参与了疾病的病理过程，是导致AS发生重要因素。异黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂，羟基能够将氢供给脂类化合物自由基，降低了自动氧化链反应的传递速度。红车轴草异黄酮中鹰嘴豆芽素A有2个羟基，芒柄花素有一个羟基，具有较强的抗氧化性。SOD和GSH－Px是生物体重要的抗氧化酶，能够降低氧自由基的积累，减轻氧化损伤［19，20］，减少MDA的积累。试验中添加红车轴草异黄酮肉鸡血清和肝脏组织中MDA含量低于低温组，脂质过氧化作用得到减轻。红车轴草异黄酮抗氧化的另一个原因，是作用于产生自由基的酶，低温条件下添加黄酮后，使肉鸡血清和肝脏组织中SOD和GSH－Px活性增强。李晓莉等［21］研究证明染料木黄酮可以显著抑制慢性缺氧小鼠MDA的产生，促进一氧化氮的生成，提高SOD活性。向瑞平等［22］研究表明肉鸡抗氧化能力增强可降低AS发病率，低温加T3诱导的AS，添加抗氧化剂Vc和Ve，肉鸡发病率以及组织中的SOD升高，MDA含量显著降低。李锦春等［23］限制光照提高了肉鸡抗氧化酶活性并减轻体内脂质过氧化作用，减少自由基的产生，减轻以非肌型肺动脉肌型化为特征的肺血管重构。红三叶异黄酮能够降低自由基介导的脂质过氧化，减轻对机体组织细胞的损伤，增强自身的防护作用。

本试验发现红三叶异黄酮一定程度上抑制了低温诱导的AS的影响，提高抗氧化性能，这可能是降低AS发病率的部分机制之一，但红三叶异黄酮与AS之间关系的更深层次的机理尚待进一步研究。

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