肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析

张建华，江炳福，程险峰，游贤惠，孟继鸿

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009;2.绍兴文理学院 医学院，浙江 绍兴 312000;3.南京市儿童医院，江苏 南京 210008)

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是一种以发热和手、足、口腔等部位的皮疹、疱疹或疱疹性咽峡炎为主要特征的小儿急性传染病。多种肠道病毒可引起HFMD，其中以肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie A16，CA16)最多见［1］。通常情况下，EV71感染引起的神经系统并发症较CA16等多见，故备受人们的关注［2］。近年来，在东南亚地区HFMD流行有上升趋势［3-6］。在我国，HFMD自1981年在上海出现以来，相继在北京、天津、福建等地均有报道［7］。2008年3月，我国安徽省阜阳市发生了较大规模的HFMD疫情，引起了社会的广泛关注［8］。目前，HFMD尚无疫苗和特异性抗病毒药物，故加强EV71和CA16的分子流行病学监测，及时了解掌握病毒变异状况和进化动态，对于控制HFMD流行、疫苗候选株的挑选等具有十分重要的意义。

本研究小组2009至2010年从南京市和马鞍山市HFMD患儿临床标本中分离出多株EV71和CA16病毒，通过扩增和测定VP1基因序列，并与标准毒株及国内外常见的参考毒株进行比较分析，研究其遗传学背景和种系进化关系，为EV71-CA16联合疫苗研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集与病毒分离

临床诊断为手足口病的患儿咽拭子和(或)肛拭子标本由南京市儿童医院和马鞍山市疾病预防与控制中心提供，－80℃保存备用。按照《手足口病预防控制指南(2009版)》关于样品采集及检测技术方案进行预处理，接种单层非洲绿猴肾细胞(Vero)，置于36℃、体积分数5%的CO2培养箱连续培养7 d，盲传2代，若出现人肠道病毒特征性的细胞病变效应(CPE)，则于－80℃保存备用。

1.2 病毒RNA提取及RT-PCR鉴定

取病毒分离物上清140 μl，用QIAamp病毒RNA抽提试剂盒(QIAGEN)提取病毒RNA。采用一步法RT-PCR试剂盒(QIAGEN)进行扩增，引物分别为肠道病毒通用引物、EV71和CA16特异性引物［9］。一步法RT-PCR 的反应体系为 20 μl，包括:RNA 5 μl，5 × RTPCR 缓冲液 4 μl，dNTP Mix(10 mmol·L－1)0.8 μl，Enzyme Mix 0.8 μl，上下游引物(10 pmol·μl－1)各0.5 μl，用水(RNase-free)补足至 20 μl。一步法 RTPCR的扩增条件为:42℃逆转录45 min;95℃变性3 min;95 ℃变性20 s，45 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，32个循环;72℃末次延伸10 min。实验设阴性对照，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.3 全长VP1基因扩增

以病毒RNA为模板逆转录合成cDNA，采用高保真PCR试剂盒(Roche)扩增VP1全长基因，EV71-VP1基因扩增采用引物EV71-VP1-F/R，CA16-VP1基因扩增采用引物CA16-VP1-F/R，引物序列见表1。PCR的反应体系为25 μl，扩增条件为:94℃ 预变性3 min;94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环;72℃末次延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收DNA后送Invitrogen公司测序。

表1 RT-PCR扩增用引物序列

1.4 基因序列分析和构建系统进化树

利用生物信息学软件DNAStar Lasergene 7.0对正反向核苷酸序列进行整理和拼接。从GenBank下载EV71和CA16原型株以及各基因型参考毒株VP1基因序列，利用MEGA 5.0进行多序列比对以及构建系统进化树。

2 结 果

2.1 EV71和CA16病毒株的分离与RT-PCR鉴定

从HFMD患者临床标本中共分离到13株病毒。用肠道病毒通用引物行RT-PCR鉴定，发现13株病毒均属于肠道病毒。在此基础上，同时用EV71和CA16特异性引物行RT-PCR，结果显示，13株病毒中9株为EV71，4 株为 CA16。

2.2 EV71和CA16分离株 VP1基因扩增和序列测定

用EV71和CA16的VP1基因区外侧引物进行PCR扩增，PCR产物大小分别为1 015 bp(EV71-VP1)和1 370 bp(CA16-VP1)，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化，送Invitrogen公司测序。

2.3 EV71结构蛋白VP1基因的序列同源性和系统进化分析

将9株新分离的EV71毒株VP1基因进行同源性分析显示，其核苷酸和氨基酸同源性分别为96.5%～99.8%和99%～100%。与EV71各基因型毒株VP1序列进行核苷酸与氨基酸同源性比对及系统进化分析，结果见表2和图1。同源性分析结果显示，9株新分离的EV71毒株与A、B基因型的毒株差异较大，但与C基因型比较接近，尤其是C4a基因亚型，其核苷酸同源性高达94.4%～100%，氨基酸同源性高达98.7%～100%。系统进化树分析显示，9株EV71毒株与C4a基因亚型处于同一分支。以上结果说明这9株EV71分离株为C4a基因亚型。

2.4 CA16结构蛋白VP1基因的序列同源性和系统进化分析

4株新分离的CA16毒株VP1基因进行同源性分析显示，其核苷酸和氨基酸同源性分别为96.2%～98.5%和99.3%～100%。与29株不同基因型的CA16参考毒株比对及系统进化分析，结果见表3和图2。同源性比对结果显示，4株CA16的VP1核苷酸序列与A基因型差异最大，B2基因亚型次之，与B1基因亚型最接近，尤其是B1b基因亚型。氨基酸序列除了A基因型外，与其他基因亚型差异不大。系统进化分析显示，4株CA16毒株与B1b基因亚型处于同一分支。这些结果说明，4株CA16毒株均属于B1b基因亚型。

表2 9株EV71与不同基因型(亚型)代表株VP1核苷酸与氨基酸同源性比较

表3 4株CA16与不同基因型(亚型)代表株VP1核苷酸与氨基酸同源性比较

3 讨 论

HFMD是一种婴幼儿常见的发热和出疹性疾病。自2008年以来，该病在中国大陆一直呈高流行态势。HFMD可由多种肠道病毒引起，其中以EV71和CA16最为多见。早期发现的HFMD主要由CA16引起，EV71于1969年在美国首次分离确认［10］，20世纪70年代以后，EV71和CA16感染交替出现。近年来，HFMD在东南亚地区疫情严重，流行过程中大多同时检测到EV71和CA16两种病原体。2008年安徽阜阳暴发的HFMD中，EV71是最主要的病原体，也有一定数量的CA16感染［11］。同年宁夏地区暴发的HFMD则以CA16感染为主［12］。最近嵇红等人报道了2008至2010年江苏省HFMD流行病学和病原学研究结果，认为轻症病例以EV71和CA16共同主导流行，而重症病例和死亡病例则以EV71感染为主［13］。

图1 基于EV71全长VP1基因核苷酸序列构建的系统进化树 “▲”为本研究新分离EV71毒株

图2 基于CA16全长VP1基因核苷酸序列构建的系统进化树 “▲”为本研究新分离CA16毒株

EV71和CA16均属于小RNA病毒科、肠道病毒属A组，基因组为单股正链RNA，约含7 400个核苷酸，仅含有1个开放读码框，包括P1、P2和P3基因区，其中P1基因编码结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。通常认为，VP1蛋白直接决定病毒的抗原性，具有与病毒血清型基本对应的遗传多样性。我们利用大肠杆菌表达了EV71全长VP1蛋白，利用间接ELISA和免疫印迹法检测显示，VP1蛋白具有良好的抗原性，可与EV71感染患者血清以及动物免疫血清良好反应［14］。故VP1区的核苷酸序列可作为肠道病毒血清型鉴定和基因分型的依据。

本次研究中共分离到9株EV71和4株CA16毒株，在测定这些毒株VP1全长基因序列的基础上进行同源性比对和系统进化树分析。这些分离毒株的VP1基因序列高度一致，9株EV71的核苷酸同源性为96.5%～99.8%，4株CA16的核苷酸同源性为96.2%～98.5%。这些数据表明，这些毒株均分别来自EV71和CA16的一个基因亚型。与EV71各基因型代表株进行比较显示，9株EV71与C4a基因亚型最接近，其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.4%～100%和98.7%～100%。董晓楠等分析了1970至2004年全球532株EV71分离株的VP1核苷酸序列，认为同源性高于85%的毒株为同一基因型，高于91%为同一基因亚型［15］。目前，根据 VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B和C基因型;B和C基因型又可进一步分为B1～B5和C1～C5基因亚型。目前，我国大陆地区流行的EV71绝大多数属于C4亚型，从系统进化树可以看出，C4亚型又可以分成C4a和C4b两个分支，2004年以前多为C4b亚型，而近年来中国大陆流行的EV71毒株几乎都是C4a亚型［16］。从图1可以看出，我们分离获得的9株 EV71也属于C4a基因亚型。

与EV71相比，CA16相对保守，VP1区基因序列变异也较小。目前，CA16的基因分型存在两种观点:一种观点认为可将CA16分为A、B、C 3个基因型，C型可进一步分为C1、C2和C3基因亚型，B和C基因型之间的差异在5.8%～11%之间，C1～C3基因亚型之间的差异在0～4.6%［17-19］;另一种观点认为不同基因型之间的差异应大于15%，这样可将CA16分为A、B两个基因型，其中B基因型又可分为B1和B2两个分支［20］。若参照EV71基因型划分标准，即不同基因型VP1的核苷酸差异应该大于15%，同一基因型不同亚型之间的差异应该在6%～11%之间，则选择上述第2种观点的分型标准较为合适。如图2所示，CA16的原型株G-10和2008年安徽阜阳株FY-18属于A基因型，其余为B基因型。B基因型又有两个分支:1支为早期CA16分离株，主要在1981至2000年间流行，划分为B2基因亚型;另1支以2000年后CA16分离株为主，划分为B1基因亚型。B1亚型又可明显地分为两大簇，分属于B1a和B1b两条进化分支。近年来国内有关CA16分子进化方面研究发现，我国目前流行的CA16毒株主要是B1亚型，而且B1a和B1b两个进化分支在同一流行地区出现共循环现象［21-23］。我们分离到的4株CA16毒株处在B1b进化分支上，故属于B1b基因亚型，与河南分离株HN1539、深圳分离株SZ/HK08-7、厦门分离株XM-3560具有最高的核苷酸同源性。目前，针对CA16的分子进化研究相对较少，尚无国际公认的基因分型标准，但随着CA16分离株的增多，GenBank收录的相关基因序列逐渐丰富，CA16的基因分型标准将会得到进一步的完善和确立。

加强对EV71和CA16的分子流行病学监测，及时了解病毒的变异趋势以及进化关系，对HFMD的预防控制、疫苗株的选择以及肠道病毒基础研究等具有重要意义。本次研究分析了苏皖地区流行的EV71和CA16毒株的VP1基因特征以及系统进化研究，为EV71和CA16疫苗株的选择提供了依据。

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