BHA诱导人脐带间充质干细胞分化为神经细胞

王卫民，丁妍

(1.湖北十堰市太和医院核医学科，湖北十堰 442000;2.湖北十堰市太和医院生命科学研究所，湖北十堰 442000)

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是来源于人脐带基质Whaton's jelly的一种干细胞，表达MSC的表面标志CD105、CD90及 CD44。最近的一些研究表明，hUC-MSCs具有免疫抑制及抑制T细胞增殖的作用［1］。而且hUC-MSCs抑制还能改善缺血性休克以及由多巴胺能神经元损伤和脊髓损伤而导致的帕金森病［2］，保护新生鼠脑白质软化灶的神经［3］。

目前，关于MSCs体外分化为神经元样细胞的报道较多，诱导方法各异，结果也不尽相同［4］。只有寻找到最简便、快速、毒性低的诱导途径，才能使hUCMSCs的临床应用真正变为现实。丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)是一种很好的抗氧剂，本研究探讨其是否能在体外将hUC-MSCs诱导分化为神经元样细胞，以期找到相对较适合的诱导条件，为hUC-MSCs移植治疗神经系统疾病奠定实验基础。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

低糖 DMEM、胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶(Gibco)，L-谷氨酰胺(Sigma)，碘化丙啶(PI，Sigma)，小鼠抗人巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)及神经胶质原纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(美国Santa)，Cy3标记的羊抗鼠二抗、FITC-标记的羊抗鼠二抗(北京天根生物技术有限公司)，BHA、DMSO(美国Sigma)，RT-PCR试剂盒(安特捷)。

1.2 hUC-MSCs的培养

培养基为DMEM+10%FBS，细胞铺满整个培养瓶的底部即用0.05%胰蛋白酶/0.04%EDTA消化、分离传代，大约每3～4 d传代1次，本实验中所用到的细胞为P4～P6。

1.3 体外定向诱导hUC-MSCs向神经细胞分化

将3至5代的细胞悬液接种于直径40 mm塑料培养皿中，细胞生长达80%至90%融合时开始进行诱导分化。实验组:先用DMEM培养基加10%FBS加1 mmol·L－1巯基乙醇(β-ME)诱导 24 h，再换成DMEM培养基加2%DMSO 加200 μmol·L－1BHA 加2 mmol·L－1β-ME 诱导72 h。对照组:不加任何诱导剂。诱导过程中在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.4 鉴定分化的神经样细胞

1.4.1 RT-PCR鉴定 分别于诱导前、诱导后1 d、诱导后3 d收集细胞，提取总RNA(Trizol法)，RT-PCR按试剂盒操作说明进行，引物序列、产物大小见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.2 免疫荧光鉴定 实验组细胞诱导1、3 d后进行神经干细胞标记物巢蛋白、神经元细胞标记物NSE及星形胶质细胞标记物GFAP免疫细胞化学鉴定。具体染色步骤如下:PBS(pH 7.4)洗涤细胞;4%多聚甲醛固定30 min以上，PBS洗涤3次，每次5 min;非免疫性动物血清封闭，室温10 min;分别滴加巢蛋白单抗(1∶50)、NSE 单抗(1∶50)、GFAP 单抗(1∶50)，4 ℃过夜;PBS冲洗3次，每次5 min;滴加二抗:Cy3标记或FITC标记的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃孵育60 min，PBS冲洗3次，每次3 min;Hoechst 33342染核5～10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，荧光显微镜下观察并照相。

2 结 果

2.1 加入诱导液后倒置显微镜下观察细胞形态变化

本实验中加入BHA进行诱导后12 h开始有少量细胞发生形态变化:原本宽大而扁平的细胞开始变小，胞体变圆变亮，折光性增强，开始出现细小的突起;诱导24 h后，大部分细胞发生类似上述形态改变;72 h后呈现明显的神经细胞样形态，相邻的细胞间轴突联结成网状，诱导的神经样细胞形态不一，有简单的双极细胞，也有复杂的多极细胞。少数诱导细胞胞体较大，突起较多，较独立存在，类似胶质细胞。有少部分细胞始终未发生形态改变，仍保持宽大扁平状。荧光染色巢蛋白、GFAP及NSE均为阳性，但NSE阳性细胞最多，达90%以上，巢蛋白阳性细胞次之，约50%，GFAP阳性细胞极少，不到1%(图1)。

2.2 RT-PCR检测诱导后不同时间点各基因的表达情况

诱导前MSC表达少量的巢蛋白，诱导24 h后巢蛋白表达升高，同时开始有MAP2及NF-L表达;诱导72 h后巢蛋白及NF-L表达较24 h有所降低，但MAP-2表达明显升高，而且NeuroD1也有较高表达。见图2。

3 讨 论

虽然骨髓是MSCs的主要来源，但是利用骨髓来源的细胞并不总是可取的，因为骨髓采集本身就是一个有创的操作，该过程中病毒的暴露率、捐献者发病率都会升高，而且细胞的数量、增殖能力、分化能力都会随着年龄的增长而降低。而脐带为分娩后废弃物，hUC-MSCs的获取过程为非侵袭性操作，无伦理限制，相关污染率也远低于骨髓来源MSCs，因此hUC-MSCs成为临床上最具应用前景的多能干细胞［5］。

目前用于诱导MSCs向神经细胞分化的因子主要有维甲酸(retinoicacid，RA)［6］、细胞生长因子 bFGF 和EGF、去甲基试剂5-氮胞苷和生长因子以及noggin［7］。此外一些具有抗氧化特性的中药如丹参注射液［8］、麝香多肽［9］等也可诱导 MSCs分化为神经元样细胞。BHA是抗氧化剂，能促进谷胱甘肽的合成，诱导细胞增殖分化［10］。β-ME能保护神经细胞在无血清培养基中的存活，促进轴突的显著增长，促进谷胱甘肽的合成，清除氧自由基［11］。已有研究报道β-ME和BHA能诱导人胎肝CD34+细胞［12］及表观修饰后的NIH/3T3细胞［13］分化为神经细胞，因而我们设想这两种因子也能快速地将hUC-MSCs诱导为神经细胞。

图1 BHA诱导后细胞形态变化及免疫荧光检测 A.对照组相差显微镜下不同时间细胞形态保持不变，细胞密度增加 ×40;B.诱导组相差显微镜下不同时间细胞形态变化 ×100;C.免疫荧光检测神经细胞相关基因巢蛋白、GFAP及NSE ×100

图2 诱导前后神经细胞相关基因表达情况 A～C为RT-PCR电泳图;D为A～C的直方图

本实验应用β-ME及抗氧化剂BHA诱导hUCMSCs向神经细胞分化。诱导72 h后发现，有较多的分化细胞表达神经元标记物NSE，少量分化细胞表达胶质细胞标记物GEAP。NSE是神经细胞特异标志之一，在神经发育的早、中、晚期均表达。RT-PCR检测诱导24及72 h时神经细胞标记物巢蛋白、NF-L、MAP-2及NeuroD1的表达情况，结果显示，诱导24 h后巢蛋白的表达率较高，72 h后有所下降，表明神经干细胞在诱导过程中逐渐分化为神经细胞而数量逐渐减少。NF-L的表达量24 h时升高，72 h时下降，而MAP2和NeuroD1的表达量逐渐增多。巢蛋白和NFL是在神经系统发育过程中表达的中间丝蛋白，是神经干细胞和神经前体细胞的标记［14］。BHA诱导hUCMSCs分化为神经元的过程为:先使其分化为神经干细胞，然后再进一步分化为成熟的神经元。因而在诱导初期巢蛋白和NF-L的表达量增多，随后又下降。MAP2是神经细胞特异微管相关蛋白，能使神经细胞维持正常的形态和功能，是成熟神经元特有的结构，位于神经元的胞体和树突，出现在神经系统发育晚期及成年期，有稳定神经元微管和保持神经元形态的作用［15］;NeuroD1是一种神经元分化因子。这二者都是神经元特异性的标志，随着诱导的进行，分化成熟的神经元越来越多，因而其表达量是逐渐增多的。

综上所述，β-ME和BHA能快速将hUC-MSCs分化为神经元。但是分化而成的神经元是否具有功能?这一问题我们将在后续的研究中进行探讨。关于β-ME和BHA诱导hUC-MSCs分化为神经元的具体机制目前尚不得而知，可能与其抗氧化、促进谷胱甘肽的合成及诱导细胞增殖分化有关。

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