米渣蛋白肽的新型酶解工艺及产品结构表征

董瑞晨，王深旗，熊 华，黎文建，赵士强，张 忠

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047）

大米糖浆制备过程得到的米渣中含有大约50%～70%的蛋白质[1]，但由于蛋白发生热变性，其水溶性很差，难以在食品加工中被广泛应用，目前大多用作动物饲料[2]。米渣蛋白拥有较全的氨基酸配比，是非常难得的优质植物蛋白[3-4]。有研究发现，蛋白质并非需在肠道中水解为游离氨基酸后才能被机体所吸收利用，而主要是以短肽形式被吸收，且机体对短肽吸收代谢速度较游离氨基酸快[5-7]。小分子肽在人体消化道可直接被人体吸收利用，溶解性好、黏度低、酸及热稳定性好，还具有抗氧化、降血压等多种生理功能[8]。目前，酶解法已取代酸解法、碱解法等，成为制备米渣蛋白肽的主要方法[9-10]。单一酶解法制备的米渣蛋白肽分子量大、溶解性和乳化能力等功能性质欠佳。胰蛋白酶（TRYP）作为特异性强的蛋白酶，为大米蛋白酶解常用酶之一。TRYP酶选择性水解蛋白中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，水解得到的赖氨酸与精氨酸所表现出的感官特性有轻度苦味[11-13]。而蛋白在复合蛋白酶（PROT）的外切肽酶及内切肽酶的共同作用下水解成为小分子肽[14]，最大限度避免了苦味肽产生，其水解条件也相对温和；同时复合蛋白酶比单一蛋白酶有更高效率和经济性[15]。本文将米渣进行预处理得到浓缩蛋白，经复合酶解，对酶解液进行脱色[16]，然后采用喷雾干燥得到米蛋白肽粉末，其流动性良好、易溶于水[17]，而后对米渣蛋白肽的分子结构表征[18]，考察相关理化和功能性质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米渣 江西恒天实业有限公司；脂肪酶（1500U/g）、中温α-淀粉酶（3000U/g）诺维信（中国）公司；福林酚试剂 北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司；胰蛋白酶（TRYP，4000U/g），复合蛋白酶（PROT，3000U/g）诺维信公司；SDS 美国Sigma公司，分析纯；硫酸钾、硫酸铜、氢氧化钠、盐酸、无水碳酸钠、TCA等其他试剂 分析纯。

U-1800紫外可见扫描仪 西安森冉生物工程有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 金坛市富华电器有限公司；FA1004电子天平 上海上平仪器公司；飞鸽牌LXJ-IIB离心机、IKA RH basic 1磁力搅拌器 江西鼎技科学仪器有限公司；DGG-9123AD台式电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 上海浦东物理光学仪器厂；雷磁PHS-3C pH计 上海精科仪器有限公司；QZP-8移动式高速离心喷雾干燥机 无锡市林洲干燥机厂；KDY-9820凯氏定氮仪 厦门精艺兴业科技有限公司；FSH-Ⅱ高速电动匀浆机 江苏金坛市环宇科学仪器厂；FT-IR Nicolet 5700傅立叶红外光谱仪 美国尼高力公司；PSA NANO 2590型纳米粒度仪 英国马尔文公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米渣蛋白肽的制备工艺

1.2.1.1 米渣前处理制备米渣蛋白 向购买的米渣中加入脂肪酶和淀粉酶以除去残余的脂质和淀粉，得到蛋白含量高的浓缩米渣蛋白[19]。其工艺流程如下：以固液比1∶6加水（准确称取200g米渣加入1200mL蒸馏水）→调节温度40℃及pH5.0→加入0.2%脂肪酶反应1.5h→升温至50℃，调节pH6.0→加入0.8%中温α-淀粉酶反应1.5h→离心，缓慢倾去上清液→以固液比1∶11加水，在温度65℃下水洗1.0h→离心，倾去上清液→相同条件下重复水洗两次。

1.2.1.2 最佳酶解条件的确定 采用TRYP酶和PROT酶协同酶解米渣蛋白，可以获得分子粒径分布较小的短肽。其工艺流程为：米渣蛋白→加酶→加水→调节pH→调温→酶解→灭酶→离心→酶解液→脱色→喷雾干燥→米渣蛋白肽粉。以米渣蛋白肽中的溶解蛋白的含量以及短肽的含量为评价指标，对酶解工艺进行优化。确定最佳的酶配比、酶解固液比、酶解温度、酶解pH和反应时间等条件。

1.2.1.3 测定方法 采用凯氏定氮法测定米渣等样品中蛋白的含量，采用福林酚法测定酶解液上清液的溶解性蛋白含量，具体步骤参照GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定。采用TCA沉淀法测定短肽含量（MW＜1ku）。具体操作为：称取一定量的米渣蛋白肽置于干净烧杯中，加入25mL 15%的TCA溶液，搅拌均匀后以10000r/min离心5min，取上清液，过滤，取定量滤液至消化管中，用半微量凯氏定氮法测定短肽含量。

1.2.2 米渣蛋白肽酶解条件的正交优化实验设计 米渣经过前处理除去脂肪、糖类后，最终得到蛋白含量为85.58%的米渣浓缩蛋白。综合考虑实验过程中的酶解效率和经济性，确定选择TRYP酶与PROT酶的比例为3∶2。在此条件下进一步探究酶解固液比、酶解时间、酶解温度及pH对酶解效果的影响，确定最佳酶解条件。根据单因素实验结果，分别选择酶解固液比1∶8、1∶9、1∶10、酶解温度45、50、55℃、酶解pH7.5、8.0、8.5、酶解时间2.5、3.0、3.5h，以酶解后酶解液中溶解性蛋白含量为指标，进行L9（34）正交实验。具体正交设计见表1。

表1 正交实验影响因素及水平Table 1 Design of orthogonal test table

1.2.3 红外吸收光谱测定米渣蛋白肽 蛋白样品受到频率连续变化的FT-IR光照射时，分子会吸收某些频率的辐射，并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化，产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁而产生吸收光谱。采用KBr压片法，样品及KBr经干燥处理后，分别称取约5mg样品及200mg纯KBr，充分混合后于球磨机中研磨，边研磨边使样品与KBr充分混匀（约2min），直至粒度小于2μm，然后将研磨混匀的混合物放入模具中，于7.0×107Pa下压成透明薄片，以KBr空白压片作参比，扫描范围4000～400cm-1，仪器分辨率4cm-1，扫描32次。分别测定米渣蛋白经TRYP酶和PROT酶协同处理前后的红外吸收光谱。

1.2.4 米渣蛋白肽分子粒径分布的测定 不同粒径范围内所含粒子的个数或质量，称为粒径分布，也称粒子的分散度。本实验方法所制得的米渣蛋白肽为均匀、稳定、粒径小的近球形颗粒，适用于粒度仪分析。在优化的工艺条件下酶解米渣蛋白，离心后取其上清液，通过PSA NANO 2590型纳米粒度仪対酶解液进行测定，可以准确地反映所制备米渣蛋白肽的粒径大小及分布情况。

1.2.5 米渣蛋白肽分子的扫描电镜观察 扫描电镜（SEM）能直接观察大试样的原始表面，观察试样各个区域的细节及生物试样。将酶解液脱色后经喷雾干燥得到米渣蛋白肽粉，取少量蛋白肽产品通过高分辨率扫描电镜观察其分子的外形轮廓和表面结构。

2 结果与讨论

2.1 米渣蛋白肽酶解条件的正交优化结果分析

表2为正交实验的极差分析结果，可以看出四因素对溶解性蛋白含量的影响程度依次为：C＞A＞D＞B，理论酶解最佳工艺组合为：A2B2C2D2，即酶解固液比1∶9、酶解温度50℃、酶解pH8.0、酶解时间3.0h。验证实验表明，米渣蛋白经此最佳工艺处理后，所得酶解液中的溶解性蛋白含量为23.49%，高于正交表中的9组实验结果，也远高于酶解前的4.35%。同时测得经此工艺处理后，酶解液中的短肽含量为16.35%，而酶解前短肽含量仅为0.97%。得到的米渣蛋白肽酶解液为澄清透明的淡红色液体，粘度小，低苦涩味。说明工艺组合A2B2C2D2为最佳酶解工艺组合，酶解效果较好。

表2 实验设计及结果Table 2 Experimental design and results

2.2 米渣蛋白肽的红外光谱图

图1 米渣蛋白肽FT-IR图谱Fig.1 The FT-IR spectra of rice residue protein

由图1可明显看出米渣蛋白的特征吸收峰，经TRYP酶和PROT酶协同酶解处理前后米渣蛋白的FT-IR图有所差异。以酶解处理前的米渣蛋白（见图1（a））为例，波数3288.37cm-1为胺基-NH2、羧基-COOH伸缩振动峰；2963.08cm-1为饱和C-H伸缩振动吸收峰；1399.43cm-1为C-H弯曲振动特征峰；1078.07cm-1为C-O、C-N伸缩振动峰；621.50cm-1为烯烃C-H面外弯曲振动峰。由图1（b）可以看出酶解后米渣蛋白肽的特征吸收峰均出现小幅的偏移，还有部分波数在1500～1000cm-1范围内的吸收峰消失，说明可能有部分杂质基团在酶解过程中被除去。另外，特征吸收峰尖锐且稳定，可推断所制备米渣蛋白肽为较纯净的蛋白肽粉末，所含基团主要为胺基-NH2、羧基-COOH及烷基C-H等。

2.3 米渣蛋白肽的粒径分布图

图2 米渣蛋白肽粒径分布状况Fig.2 The particle size distribution of rice residue peptide

图2结果显示，米渣蛋白肽分子粒径分布在110.1～356.2nm范围之间，其中在198.0nm的含量最高，为

36.4 %，平均粒径为233.5nm，而且其粒径分布比较均匀，颗粒较小，分布范围较窄，表明米渣蛋白酶解充分，经过酶解裂解为相对分子质量较小的肽段，最终形成均匀、稳定的小颗粒。

2.4 米渣蛋白肽的扫描电镜图

图3 米渣蛋白肽SEM图Fig.3 The SEM photograph of rice residue peptide

图3显示了米渣蛋白肽的SEM图，可见米渣蛋白肽分子彼此团聚交联在一起，成为直径较大的不规则球体颗粒，表面凹凸不平，部分球体还存在破孔现象。球体的直径约为150μm，应为大量小分子肽团聚交联所致。

3 结论

采用新型的酶解工艺后，米渣蛋白中溶解性蛋白含量及短肽含量明显升高，有助于人体吸收。最佳酶解工艺条件为：胰蛋白酶与复合蛋白酶配比为3∶2、酶解固液比1∶9、温度50℃、pH8.0、时间3.0h。由此得到的蛋白肽产品的溶解性蛋白含量从4.35%升高至23.49%，小分子短肽含量从0.97%提高到16.35%。对产品结构表征发现，其特征吸收峰尖锐且稳定，杂峰较少，表明采用此工艺制得的蛋白肽较纯；溶解液粒径分布均匀，粒径平均为233.5nm；SEM显示小分子蛋白肽容易团聚包裹在一起形成不规则球状颗粒。

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