琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳及高分辨熔解曲线技术在α-地中海贫血新生儿筛查中的应用

唐海深 满婷婷 江陵 张金云 李东至

（1.中山市博爱医院 产前诊断中心，广东 中山 528400；2.清远市人民医院 产前诊断中心，广东 清远 511518；3.广州市妇女儿童医疗中心 产前诊断中心，广东 广州 510623）

α-地中海贫血（简称α-地贫）是由于α-珠蛋白基因缺失或突变使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血。临床上分为静止型、标准型、Hb H病和血红蛋白Bart′s胎儿水肿综合征4种类型，其分子机制分别为1、2、3、4个α基因缺陷（缺失或突变）。血红蛋白Bart′s胎儿水肿综合征（主要由—SEA纯合子引起），胎儿一般在妊娠23～38周或出生后数小时死亡。因此在α-地贫高危地区进行人群筛查，是识别高危人群、预防重型地贫患儿出生的重要手段。正常胎儿和新生儿的血红蛋白成分主要是 HbF（α2γ2），若α-珠蛋白链减少或缺乏会导致γ-珠蛋白链的相对增多，聚合成Hb Bart′s（γ4），因此，脐血中 Hb Bart′s与α-地贫直接相关。目前应用较多的Hb Bart′s检测方法有：琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱法和毛细管电泳。本文同时应用毛细管电泳与琼脂糖凝胶电泳筛查新生儿α-地贫，比较2种方法的价值。此外，本研究通过采用HRM技术筛查3种常见非缺失型α-地贫以探讨该技术的实用价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象 2010年6～12月在清远市人民医院产科分娩的1442例新生儿。

1.2 标本采集 新生儿分娩断脐后，从胎盘端脐带抽吸2ml脐带血，放入EDTA.K2抗凝管，用于血红蛋白电泳及地贫基因检测。

1.3 琼脂糖凝胶电泳Hb Bart′s定量 采用美国Helena Laboratories公司的电泳仪进行脐带血琼脂凝胶Hb电泳分析，经染色后在Optiscan光密度扫描仪上进行区带扫描定量。

1.4 毛细管电泳Hb Bart′s定量 脐血样品先3000转离心3分钟，取18μl血细胞溶于90μl的溶血素中充分混匀后上机检测。采用法国Sebia公司Capillarys 2全自动毛细管电泳仪及配套试剂，在9.8 k V电压、p H 9.4的碱性缓冲液条件下，在石英毛细管内进行血红蛋白电泳，用415 nm波长检测各种血红蛋白的百分比，从而定量Hb Bart′s。电泳图谱分成15个区：不同的血红蛋白峰出现在特定的区域内：Hb A2＝Z3，Hb F＝Z7，Hb A＝Z9，Hb Bart＇s＝Z12，Hb H＝Z15［1，2］。

1.5 基因分型

1.5.1 DNA提取 收集任意一种电泳方法筛查Hb Bart′s阳性的样本，用富士quick genemini80DNA提取仪，按DNA提取试剂盒使用说明，提取新生儿脐血中白细胞的全基因组DNA。

1.5.2 gap-PCR技术检测3种常见缺失型α-地贫基因 采用gap-PCR技术检测所有Hb Bart′s阳性样本的3种常见缺失型α-地贫基因（—SEA、-α3.7、-α4.2）［3］。

1.5.3 HRM技术筛查α-基因的第三外显子 从UCSC基因组数据库（http：／／genome.ucsc.edu）获得α-珠蛋白基因的DNA序列。用LightScanner Primer Design Software设计一对引物（正向引物：5′-CCGCACTGACCCTCTTCTCT-3′，反 向 引 物：5′-GCAACCGAGGCTCCAGC-3′）。挑出 gap-PCR技术未检测出异常的Hb Bart′s阳性样本DNA，同时选取2例基因型分别为αCSα／αα和αQSα／αα的阳性对照样本及16例基因测序验证为第三外显子无突变的阴性对照样本DNA，利用96孔板，加入1×LC Greens Plus，扩增α-基因（包含α1-和α2-基因）的第三外显子，PCR扩增片段长度为172 bp。PCR扩增完成后，将96孔板移至LightScanner（Idaho Technology）进行熔解曲线分析［4］。

1.5.4 用反向点杂交（RDB）技术检测3种常见非缺失型α-地贫基因 对gap-PCR未检出异常的样本，用HRM技术筛查后，应用反向点杂交 （RDB）技术检测3种常见非缺失型α-地贫基因（Hb CS、Hb QS和 Hb WS）［5］。

1.5.5 直接测序法检测检测α1-和α2-基因全长从 UCSC数据库（http：／／genome.ucsc.edu）中获取α-珠蛋白基因（α1-和α2-基因）的 DNA 序列，应用LightScanner Primer Design软件设计2对引物，分别扩增α1-和α2-珠蛋白基因（包含3个外显子及部分上游和下游序列），引物序列详见表1。对于未知基因型的Hb Bart′s阳性样品，用PCR产物直接测序法检测α1-和α2-基因的全长。

1.5.6 统计 采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，计量数据以“均数±标准差”表示，均数的比较采用t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

表1 α-珠蛋白基因全长测序所用的引物

2 结 果

2.1 α-地贫基因的携带率 本研究共筛查1442例新生儿，经基因分析，167例明确了α-地贫基因型（包括165例杂合子、2例双重杂合子），即本研究中共检出α-地贫等位基因169个，人群基因携带率为11.72%（169／1442）。

2.2 α-地贫等位基因的组成 169个α-地贫等位基因中东南亚缺失型（—SEA）112例，占总体的66.3%（112／169）；3种常见的缺失型（—SEA、-α3.7、-α4.2）占94.1%（159／169）；东南亚缺失型（—SEA）占3种常见缺失型的70.4%（112／159）；非缺失型α-地贫基因也有相当的比重（αCSα、αQSα和 αWSα占5.9%），以αCSα、αQSα为主。

2.3 Hb Bart′s含量与α-地贫基因型的关系1442例新生儿脐血样本中，2种电泳方法Hb Bart′s均为阳性的样本151例（琼脂糖凝胶电泳Hb Bart′s含量为0.5%～18.6%，毛细管电泳Hb Bart′s含量为0.1%～21.6%），基因确诊150例。4例琼脂糖凝胶电泳检测 Hb Bart′s阳性（Hb Bart′s含量0.8%～2.57%），而毛细管电泳检测Hb Bart′s阴性的样本，基因检测未见异常。7例琼脂糖凝胶电泳检测Hb Bart′s阴性而毛细管电泳检测Hb Bart′s阳性的样本（毛细管电泳Hb Bart′s含量0.1%～0.9%），基因检测均为静止型α-地贫。剩余1280例2种电泳Hb Bart′s均为阴性的样本进行2种常见静止型α地贫基因（-α3.7、-α4.2）的分子筛查，查出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα。2种电泳方法筛查，脐血Hb Bart′s的含量均随着α-基因缺陷（缺失或突变）的个数的增加而升高，Hb H病（3个α-基因缺陷）高于α0-地贫（2个α-基因缺陷）及α＋-地贫（1个α-基因缺陷），α0-地贫高于α＋-地贫。α＋-地贫中，不同基因型的 Hb Bart′s水平亦存在差异，αCSα／αα高于其它基因型。详见表2。

表2 151例2种电泳方法Hb Bart′s均为阳性的样本基因诊断结果

2.4 2种电泳方法的筛查特异性比较 151例2种电泳方法Hb Bart′s均为阳性的样本，基因确诊150例。4例琼脂糖凝胶电泳检测Hb Bart′s阳性而毛细管电泳检测Hb Bart′s阴性的样本，基因检测未见异常；7例琼脂糖凝胶电泳检测Hb Bart′s阴性而毛细管电泳检测Hb Bart′s阳性的样本，基因检测均为静止型α-地贫，见表3。剩余1280例2种电泳Hb Bart′s均为阴性的样本进行2种常见静止型α地贫基因（-α3.7、-α4.2）的分子筛查，查出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα，见表4。

表3 11例仅一种电泳方法Hb Bart′s阳性的样本基因诊断结果

表4 1280例2种电泳方法Hb Bart′s均为阴性的样本基因诊断结果

2.5 HRM技术的敏感性及特异性 Hb Bart′s阳性，gap-PCR技术未检出异常的样本共15例，2例基因型分别为αCSα／αα和αQSα／αα的阳性对照及12例基因测序验证为第三外显子无突变的阴性对照样本，总共29例，全部扩增成功，并获得HRM熔解曲线（图1）。29例样本共形成4簇明曲线：7例与已知基因型为αCSα／αα样本曲线集成一簇的待测样本基因确诊为αCSα／αα；3例与已知基因型为αQSα／αα样本曲线集成一簇的待测样本基因确诊为αQSα／αα；单独成一簇曲线与正常样本分开的1例待测样本基因确诊为αWSα／αα；5例与正常样本集成一簇的待测样本，DNA测序第三外显子未见突变。

图1 HRM技术筛查α-基因第三外显子的结果图

3 讨 论

人在不同发育时期血红蛋白组成不同，正常胎儿和新生儿的血红蛋白成分主要是 Hb F（α2γ2）；成人期血红蛋白组成为：Hb A（α2β2）：96.5%～97.5%，Hb A2（α2δ2）：2.5% ～3.5%，Hb F（α2γ2）：0～1.0%。若α-珠蛋白链减少或缺乏会导致γ-珠蛋白链的相对增多，未与α-链结合的γ-链聚合成 Hb Bart′s（γ4）。因此，脐血中 Hb Bart′s与α-地贫直接相关。由于Hb Bart′s于出生3～6个月后即消失，理论上α-地贫的筛查最适合于新生儿期进行，以降低漏检率。本研究显示，清远市户籍人群总基因携带率达11.72%，高于广东省的平均水平8.53%［6］。其中以缺失型α-地贫1基因（—SEA）为主（66.3%），突变型α-地贫基因也有相当的比重（αCSα、αQSα和αWSα占5.9%）。

近年来，随着全自动毛细管电泳技术的发展，克服了传统电泳技术的缺点。毛细管电泳在操作方便性、操作时间、少试剂耗材、解析能力、检测重复性及检测成果清晰度均大大优于琼脂糖凝胶电泳，分离、定量 Hb Bart′s更加简单、准确［2］。本研究1442例样本中，151例2种电泳方法Hb Bart′s均为阳性的样本，基因确诊150例。对于4例琼脂糖凝胶电泳检测Hb Bart′s阳性而毛细管电泳检测Hb Bart′s阴性的样本，基因检测未见异常。7例琼脂糖凝胶电泳检测Hb Bart′s阴性而毛细管电泳检测Hb Bart′s阳性的样本，基因检测均为静止型α-地贫。1280例两种电泳Hb Bart′s均为阴性的样本进行2种常见静止型α地贫基因（-α3.7、-α4.2）的分子筛查，查出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα。可见，毛细管电泳分离定量Hb Bart′s的灵敏度及特异度均大于琼脂糖凝胶电泳。因此，全自动毛细管电泳技术分离定量 Hb Bart′s具有简便、高效、准确的特点，在α-地贫高发地区，该技术应常规应用于新生儿α-地贫筛查，以减少出生缺陷，提高人口素质。

脐血Hb Bart′s的含量与α-基因缺陷（缺失或突变）的个数呈正相关。本研究显示，毛细管电泳Hb Bart′s定量，α0-地贫的 Hb Bart′s的含量均大于1%，Hb H 病的 Hb Bart′s含量更高。而α＋-地贫中，除基因型为αCSα／αα的样本 Hb Bart′s含量均大于1%以外，其他类型的α＋-地贫携带者Hb Bart′s含量均小于1%，其中-α3.7／αα携带者的 Hb Bart′s含量最低为0.1%。1280例2种电泳Hb Bart′s均为阴性的样本检出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα。因此以脐血Hb Bart′s阳性为指标，对新生儿进行α-地贫筛查，能较准确地筛查出Hb H病、α0地贫及αCSα／αα，但是，Hb Bart′s水平不宜作为αCSα以外的α＋-地贫的筛查指标。然而随着电泳技术的不断发展，静止型α-地贫的检出率逐步提高。

本研究中，尚有1例毛细管电泳Hb Bart′s阳性的样本未知基因型（Hb Bart′s含量为0.30%），可能的原因有：已有研究发现，中国人群中存在-α2..7缺失，累及α1-基因，本研究只检测了-α3.7和-α4.2两种缺失型α＋-地贫，有可能存在罕见的缺失型α＋-地贫未检测到［7］；存在直接测序法检测α1-和α2-基因全长无法检测到的，影响α基因表达的上游突变；该峰为Z12区段非Hb Bart′s的异常血红蛋白。

Munkongdee T等［1］对587例泰国新生儿脐血进行毛细管电泳电泳Hb Bart′s定量筛查α-地贫，研究显示：缺失1、2、3个α-基因的α-地贫携带者，其脐血Hb Bart′s含量分别为0.5%±0.2%、4.6%±0.5%、20.1%；该研究还显示，正常人与α＋n-地贫携带者之间的Hb Bart′s含量相互重叠、不能区分，以Hb Bart′s含量0.2%为界，区分正常人与α＋-地贫携带者的效率最高。何晓玲等［8］，亦用毛细管电泳电泳技术定量Hb Bart′s的方法筛查中山市新生儿的α-地贫。本研究结果中Hb Bart′s的含量与基因缺陷个数的关系与Munkongdee T及何晓玲的研究相符，但是，本研究以Hb Bart′s含量0.1%为界，区分正常人与α-地贫携带者，Hb Bart′s阳性样本151例，缺失型α＋-地贫只检测了-α3.7和-α4.2两种基因型，即有150例经基因分析确诊为α-地贫，另外1例Hb Bart′s阳性的样品仍然可能存在未检测到的α-基因缺陷。因此，我们认为将新生儿脐血毛细管电泳Hb Bart′s含量0.1%作为区分正常人与α-地贫携带者的指标更为理想。

与缺失型Hb H病相比，非缺失型Hb H病临床表现更为严重，更有αQSα／αQSα及—SEA／αQSα能引起水肿胎的报道［9，10］。因此筛查Hb CS和Hb QS有利遗传咨询指导婚姻，对优生优育具有十分重要的意义。本研究显示，HRM技术筛查非缺失型α-地贫的敏感性和特异性亦均达100%，结果与陆林苑等［4］的研究相符。由于PCR扩增和HRM分析整个过程用时不超过2小时，HRM分析法与普通PCR相比，只需在PCR反应体系中多加1种DNA饱和荧光染料，每个样本的试剂费用不超过2元。因此，HRM技术可作为非缺失型α-地贫（尤其是αCSα和αQSα）的一种筛查方法，且具有准确、高效、低成本的优点。

［1］Munkongdee T，Pichanun D，Butthep P，et al.Quantitative analysis of Hb Bart＇s in cord blood by capillary electrophoresis system［J］.Ann Hematol，2011，90（7）：741-746.

［2］Keren DF，Hedstrom D，Gulbranson R，et al.Comparison of Sebia Capillarys capillary electrophoresis with the Primus high-pressure liquid chromatography in the evaluation of hemoglobinopathies［J］.Am J Clin Pathol，2008，130（5）：824-831.

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［4］陆林苑，唐海深，李东至.高分辨率熔解曲线分析技术在非缺失型α-地中海贫血新生儿筛查中的前瞻性应用［J］.中国妇幼保健，2013，28（1）：156-159.

［5］郭广洲，陈延娥，廖生赟，等.应用反向点杂交法检测α-地中海贫血点突变［J］.热带医学杂志，2008（8）：785-787.

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［7］张俊武，龙桂芳.血红蛋白与血红蛋白病［M］.南宁：广西科学技术出版社，2003：212-215.

［8］何晓玲，张翠梅，冯华俊.中山市α-地中海贫血的新生儿筛查［J］.右江民族医学院学报，2010，32（4）：488-490.

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［10］Li DZ，Liao C，Li J，et al.Hemoglobin H hydrops fetalis syndrome resulting from the association of the—SEAdeletion and the alpha Quong Szealpha mutation in a Chinese woman［J］.Eur J Haematol，2005，75（3）：259-261.