青黛中靛玉红的提取及其抗氧化活性*

陈莉华，王晓静，廖 薇，肖 斌，谭林艳，龙进国

(1.吉首大学化学化工学院，湖南吉首 416000;2.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首 416000)

青黛中靛玉红的提取及其抗氧化活性*

陈莉华1，2，王晓静1，廖 薇1，肖 斌1，谭林艳1，龙进国1

(1.吉首大学化学化工学院，湖南吉首 416000;2.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首 416000)

利用超声波辅助乙酸乙酯提取青黛中靛玉红，考察提取物对羟基自由基的清除作用及对油脂氧化的抑制效果，并与柠檬酸和Vc作比较.用乙酸乙酯为提取剂，料液比为1∶10(g/mL)，在40 W超声功率、13 kHz超声频率及250 W加热功率的条件下超声50 min，提取率达到0.12%.提取物对羟基自由基有一定的清除作用，并呈现一定的量效关系，能增加植物油的抗氧化能力，相同条件下对油脂的抗氧化效果强于Vc、柠檬酸.

超声波;乙酸乙酯;青黛;靛玉红;抗氧化活性

青黛是一种常用传统中药，为十字花科菘蓝Isatis indigotica For-tune、蓼科蓼蓝Polygonumtinctorium Ait.、爵床科马蓝Bap-hicacanthuscusia Bremek.和豆科假蓝靛Indigoferatinctoria L.的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末或团块，收载于《中国药典》2005版一部［1］，具有清热解毒、凉血消肿、散结止痛、消斑化瘀之功效，主要用于温毒发斑、血热吐吜、胸痛咳血、口疮、痄腮、喉痹、小儿惊痫等症［2］.

青黛的主要活性成分是靛蓝(indigo)与靛玉红(indirubin)［3］.前人的研究主要集中在青黛中靛玉红的清热凉血、抗菌消炎［4-5］、抑制肿瘤细胞［6-7］等生物活性方面.迄今为止，关于青黛中靛玉红抗氧化作用的研究尚未见报道.笔者利用超声波辅助乙酸乙酯提取青黛中靛玉红，研究提取物对羟基自由基亚的清除作用及对油脂氧化的抑制作用，以期为青黛的进一步开发提供实验依据.

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

仪器:723可见分光光度计(日本岛津);KQ250-E型超声波清洗器(郑州长城科工贸有限公司);K-201B-Ⅱ旋转蒸发器(郑州长城科工贸有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);Gzx-9070MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);电子天平;恒温槽.

试剂:盐酸、石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、亚硝酸钠、柠檬酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、三羟基甲基氨基甲烷、邻苯三酚、氯仿三氯甲烷、冰醋酸、碘化钾、淀粉等，均为分析纯.

材料:植物油(购买于吉首市超市)、青黛(购于吉首市中草药店).

1.2 试验方法

1.2.1 青黛中靛玉红的提取及分离 (1)青黛超声预处理.准确称取青黛成药10.0 g，置于250 mL的烧杯中，取24%盐酸溶液50 mL，分5次加入并不断搅拌至没有气泡产生，将烧杯封口，置于80℃的超声发生器中超声50 min后取出烧杯静置10 min，减压抽滤，然后用90℃左右热水50 mL，分5次洗涤滤渣并置于80℃的烘箱中干燥后保存.

(2)石油醚回流脱脂.将上一步得到的干燥的滤渣用10倍量的石油醚于80℃超声回流50 min，静置10 min冷却至室温，减压抽滤，用10 mL石油醚分2次洗涤滤渣，于80℃烘箱中干燥后保存.

(3)乙酸乙酯回流提取.将上一步得到的干燥的滤渣用10倍量的乙酸乙酯在80℃超声回流50 min，静置10 min，冷却至室温，减压抽滤，取20 mL乙酸乙酯分4次洗涤滤渣，弃去滤渣，滤液保存于一棕色试剂瓶中.

初提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，温度为75℃，浓缩液置于步骤(3)的棕色试剂瓶中，于旋转蒸发仪进一步减压浓缩至蒸干，温度为75℃，蒸干的残渣加入95%乙醇50 mL和1%NaOH 100 mL，搅拌均匀，静置24 h，减压抽滤，滤液于旋转蒸发仪减压回收乙醇，温度为70℃;滤渣于80℃烘箱干燥渣后保存，滤渣即为靛玉红粉末.

1.2.2 提取物中靛玉红含量的测定 以靛玉红为标准品，用紫外分光光度计在540 nm处测定吸光度，绘制靛玉红浓度-吸光值标准曲线.

将提取得到的靛玉红粉末置于烧杯中并放在80℃水浴超声50 min，同时取20 mL乙酸乙酯分4次加入其中，溶解时烧杯封口，冷却至室温，转入100 mL的容量瓶中，用乙醇稀释至刻度定容，摇匀，放置1 0 min，用乙醇为试剂空白，用紫外分光光度计在540 nm处测定此溶液的吸光值，由回归方程计算靛玉红含量.

1.2.3 靛玉红对羟基自由基的清除 参照Fenton反应［8］建立羟基自由基生成模型，在15 mL比色管中依次加入2 mmol/L FeSO4溶液3 mL，2 mmol/L H2O2溶液3 mL，摇匀后，加入6 mmol/L水杨酸溶液3 mL，立即摇匀，于37℃水浴中恒温15 min后取出，然后分别加入浓度为72.65 mg/L的提取液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，最后加入蒸馏水补充体积至15 mL.继续在37℃水浴恒温15 min，在波长5 10 nm处以空白液为参比测定其吸光度Ax及本底吸光度Ax0.以蒸馏水代替提取液，按以上方法实验，在37℃下恒温15 min后测其吸光度A0.以同浓度抗坏血酸、柠檬酸做对比，比较3种物质的清除羟基自由基能力.每组测定重复3次，按下式据算羟基自由基的清除率:

其中:A0为空白对照液吸光值;Ax为待测样品液吸光度;Ax0为本底吸光度.

1.2.4 靛玉红对油脂氧化的抑制作用 采用国际上通用的烘箱强化贮存法［9］使之发生氧化酸败变质，并利用碘量法［10］测定过氧化值.

通过烘箱强化贮存法使油脂发生氧化，加入靛玉红考察其对油脂氧化作用的抑制:称取20 g油脂，加入2 mL纯化液，搅拌均匀后，放入烘箱中强化保存，间隔1 h交换在烘箱中的位置并取1 mL待测样品，参照标准曲线方法分别测定585 nm处的吸光度.然后计算油脂过氧化值(POV)及原花青素对油脂的保护率η，以抗坏血酸、柠檬酸做对比，比较3种物质的抗氧化能力.

油脂过氧化值(POV)和保护率η的计算公式分别为

其中:W表示油脂质量(kg);POV初为未对油脂进行强化氧化时的过氧化值，mmol/kg;POV末1为添加靛玉红的油脂强化氧化后的过氧化值，mmol/kg;POV末2为未添加靛玉红的油脂强化氧化后的过氧化值，mmol/ kg.

2 结果与讨论

2.1 青黛靛玉红含量测定及提取率

在实验确定的最佳条件下青黛中靛玉红提取率为0.12%.在540 nm处吸光值与靛玉红的浓度有良好的线性关系，回归方程为A=0.012c+0.008 2，R2=0.998 1.亚硝酸盐测定的回归方程A=0.396 9c+0.040 3，R2=0.996 9，亚硝酸盐在0.0～0.2 mg/L之间有良好的线性关系.碘量M(μmol)与吸光度A在0.0～0.96 μmol间有良好的线性关系，回归方程为M=4.015 3A+0.003 9，R2=0.998 6.

2.2 青黛靛玉红对羟基自由基(·OH)的清除

2.2.1 靛玉红浓度对羟基自由基(·OH)清除效果的影响 按照实验方法，对一系列不同浓度的靛玉红提取液、抗坏血酸溶液及柠檬酸溶液进行实验，考察各自对羟基自由基的清除效果，并进行比较，结果如图1所示.

图1结果表明，在浓度2.4～17 mg/L范围内，随着靛玉红提取液质量浓度的增大，靛玉红对羟自由基清除效果逐渐增大，在实验浓度为1 6.95 mg/L时，清除率为15.4%，但清除效果不及抗坏血酸、柠檬酸.总体而言，对羟自由基清除率的排序从大到小为柠檬酸，抗坏血酸，靛玉红提取液;在浓度2.4～17 mg/L范围内三者清除率均与浓度剂量呈正相关.

2.2.2 温度对靛玉红清除羟基自由基效果的影响 以浓度均为9.68 mg/L的靛玉红提取物、抗坏血酸及柠檬酸，考察不同温度对清除羟基自由基效果的影响，结果如图2所示.

图2结果表明，同一浓度不同温度下的清除率有很大的不同.温度较低时，对羟基自由基的清除率较小;随着温度升高，对羟基自由基的清除率逐渐增大，但当温度升高到一定程度后，其清除率有下降的趋势.在37℃时抗坏血酸及柠檬酸的对羟基自由基清除率最大;但靛玉红提取液在42℃时对羟基自由基清除率最大(13.71%).原因可能是靛玉红的耐高温性较强，在较高温度下才发生自身氧化，因此在较高温度下仍可以清除羟基自由基.

图2 温度对靛玉红提取液清除·OH能力的影响

2.3靛玉红对油脂的抗氧化性研究

2.3.1 靛玉红浓度对油脂的抗氧化性效果的影响 按照实验方法，40℃条件下，将植物油在烘箱强制保温一定时间，对一系列不同浓度的靛玉红提取液、抗坏血酸溶液及柠檬酸溶液进行实验，考察其对植物油的保护效果，结果如图3所示.

图3结果表明，在浓度2.4～17 mg/L范围内，靛玉红对植物油的保护率较柠檬酸、抗坏血酸的大，其对油脂的抗氧化作用十分的明显.随着靛玉红质量浓度的增大，保护率逐渐增大，在实验浓度为1 6.95 mg/L时，清除率为55.77%，由此可得出靛玉红对植物油氧化的抑制效果很好.总体而言，对植物油氧化的抑制作用排序从大到小为青黛靛玉红提取液，抗坏血酸，柠檬酸;在浓度2.4～17 mg/L范围内三者对油脂的保护率均与浓度剂量呈正相关.

2.3.2温度对靛玉红抗氧化性效果的影响 以浓度均为9.68 mg/L的靛玉红提取物、抗坏血酸及柠檬酸，考察不同温度对植物油的保护效果，结果如图4所示.

图4结果表明，同一浓度不同温度靛玉红对植物油的保护率影响很明显.同时表明，温度较低时，靛玉红对植物油的保护率较小;随着温度升高，靛玉红对植物油的保护率迅速增大，但当温度升高到一定程度后，其保护率几乎不变.而对于抗坏血酸及柠檬酸，在42℃时均对植物油保护率最大;随后二者有下降的趋势.原因可能是靛玉红的耐高温性较强，在较高温度下才发生自身氧化，因此在较高温度下仍可以保护植物油.

图3 浓度对靛玉红提取液抑制植物油氧化效果的影响

图4 温度对靛玉红提取液抗植物油氧化的影响

3 结语

以乙酸乙酯为提取剂，料液比为1∶10(g/mL)，40 W的超声功率超声50 min的条件下，青黛中靛玉红提取率为0.12%.靛玉红提取液对·OH有一定的清除作用，且清除效果与其浓度有剂量效应关系，能很好抑制油脂的氧化作用，在浓度2.4～17 mg/L范围内，它对植物油的保护率在15.77%～55.77%，大于Vc及柠檬酸.青黛中的靛玉红具有良好的抗氧化能力，作为一种新的天然、保健的绿色食品抗氧化剂，具有良好的开发前景.

［1］ 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京:化学工业出版社，2005:138.

［2］ 赫微微，温红珠，李 佳，等.靛玉红对溃疡性结肠炎小鼠CD4CD25Treg细胞Foxp3表达的影响［J］.上海中医药杂志，2011，12:82-84.

［3］ 谢友良，何百寅，李远彬，等.青黛药材中的靛蓝和靛玉红含量的同时测定［J］.中药新药与临床药理，2011，22(4): 452-455.

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［5］ 农志新，兰日程.普济消毒饮合青黛治疗流行性腮腺炎疗效观察［J］.广西中医学院学报，2010，13(2):15-17.

［6］ 吴琦玮，葛忠良，高 月，等.靛玉红对肿瘤细胞抑制作用的研究及相关机制探讨［J］.天津中医药，2008，25(1):55-58.

［7］ 刘雅波，陶文沂.18种青黛7-氮杂靛玉红对6种肿瘤细胞增殖的影响［J］.天然产物研究与开发，2010，22:899-906.

［8］ 陈莉华，左林艳，唐玉坚.微波辅助乙醇提取姜辣素及其对油脂的抗氧化性研究［J］.食品科学，2011，32(04):69-73.

［9］ 张俊生，陈莉华，张文龙.湘西节节草总黄酮的超声波提取及抗氧化研究［J］.食品科学，2011，32(16):71-75.

［10］ 邓 斌，王存嫦，徐安武.微波辅助提取花生壳黄酮类化合物及其抗氧化性研究［J］.中国油脂，2009，34(3):54-57.

(责任编辑 易必武)

Extraction of Indirubin from Indigo Naturalis and Its Antioxidant Activity

CHEN Li-hua1，2，WANG Xiao-jing1，LIAO Wei1，XIAO Bin1，TAN Lin-yan1，LONG Jin-guo1
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou 416000，Hunan China;2.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization，Jishou University，Jishou 416000，Hunan China)

The indirubin was extracted fromnatural indigosby using ultrasonic-assisted ethyl acetate.With the same concentration of ascorbic acid and Vc as the control，the antioxidant activity of indirubin was investigated by testing scavenging effects of·OH and against the peroxidation of oils.The results showed that the extraction ratio of indirubin reached 0.12%under the following conditions:ethyl acetate as extraction agent，1∶10(g/mL)of material-liquid-ratio，40 w ultrasonic power，13 kHz ultrasonic frequency and 250 W heating power within 50 min.Indirubin extract exhibited ability to remove·OHand good inhibitory effect on peroxidation of oils.The antioxidant activity was increased with concentration of indirubin increasing，and the activity was better than those of ascorbic acid and Vc.

ultrasonic;ethyl acetate;indigo naturalis;indirubin;antioxidant activity

R284.1

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2013.01.017

1007-2985(2013)01-0072-05

2012-10-31

科技部科技型中小企业技术创新基金资助项目(10C26214302421;11C26414305373);湘西自治州科技计划项目;吉首大学大学生创新基金资助项目(2011ZXJJ05)

陈莉华(1961-)，女，湖南吉首人，吉首大学化学化工学院教授，博士，主要从事纳米粒子的生物应用研究.