栀子中两种活性成分的含量测定

王晓娟 孙兆林 季宇彬 李志雄

(1哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨，150076;2中国科学院上海药物研究所，上海)

栀子始载于《神农本草经》，为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实，味苦、性寒，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效，主治热病心烦、黄疸尿赤、淋证涩痛、血热吐衄，也可外治扭挫伤痛［1］。栀子中主要成分为环烯醚萜类，栀子苷、京尼平苷龙胆二糖苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯等是栀子中的主要生物活性成分，现代药理研究表明他们具有抗炎、利胆、镇静、抗老年痴呆等作用［2－3］。目前，有研究发现栀子还有抗流感病毒活性，吸收入血的有效成分含有栀子苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、山栀苷甲酯［4］等。对栀子进行含量测定的文献报道多是单独测定栀子苷，我们建立同时测定去乙酰车叶草苷酸甲酯和栀子苷含量的方法，为栀子资源的充分利用提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100色谱系统和英谱色谱工作站，KS5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所提供)，批号:110749－200714，去乙酰车叶草苷酸甲酯，实验室自制，对照品纯度均＞98%，分析天平(梅特勒－托利多XS105DU)。

乙腈(色谱纯)，水(二次蒸馏水)，其他试剂均为分析纯，栀子药材购自上海康桥中药饮片有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:乙腈 －0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱:0 min→6 min→20 min→28 min→32 min，乙腈5%→10%→15%→40%→5%，检测波长:238 nm，流速:1.0 mL/min，柱温:25℃，进样量:20 μL。

2.2 对照品溶液的制备 分别取栀子苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯对照品适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇制成浓度分别为0.846 mg/mL、0.186 mg/mL的对照品溶液，将两个对照品溶液稀释适当倍数后制成混合对照品溶液。

2.3 样品溶液的制备 称取栀子粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液过滤，即得。

2.4 系统适应性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各20 μL，依法测定，记录色谱图，结果如图1所示。去乙酰车叶草苷酸甲酯、栀子苷保留时间分别为 10.0 min、22.5 min，理论塔板数分别为19354、36296，与相邻峰的分离度均大于1.5。

图1 栀子HPLC色谱图

2.5 线性范围的考察 分别精密吸取2.2项下的对照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL 置 10 mL 容量瓶中用50%甲醇稀释至刻度，分别精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程:去乙酰车叶草苷酸甲酯:A=18364C+30964，r=0.9994，线性范围为 0.009 ～0.186 mg/mL，栀子苷:A=23495C+238661，r=0.9996，线性范围为0.042 ～0.846 mg/mL。

图2 去乙酰车叶草苷酸甲酯标准曲线

图3 栀子苷标准曲线

2.6 精密度试验 精密吸取2.2项下混合对照品溶液20 μL，分别连续进样6次，测得去乙酰车叶草苷酸甲酯、栀子苷峰面积的RSD分别为0.78%、0.67%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取本品供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h 进样测定，测得去乙酰车叶草苷酸甲酯、栀子苷峰面积的RSD分别为0.63%，0.76%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一批栀子粉末，平行制备6份供试品溶液，分别进样测定，计算去乙酰车叶草苷酸甲酯、栀子苷的平均含量，其 RSD值分别为0.98%、1.16%，表明本方法的重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称定已知含量栀子药材粉末6份，每份约0.25 g，按供试品溶液制备方法，分别制成供试液。分别精密称定去乙酰车叶草苷酸甲酯、栀子苷适量制成浓度为0.132 mg/mL、0.338 mg/mL的对照品溶液，将去乙酰车叶草苷酸甲酯对照品稀释10倍，分别取对照品溶液1 mL，供试液1 mL混合均匀，依法测定两种成分的含量，结果表明去乙酰车叶草苷酸甲酯、栀子苷的平均回收率(n=6)分别为97.07%(RSD=1.48%)，100.51%(RSD=1.29%)。

2.10 样品测定 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，按上述条件测定其峰面积并按外标法计算两种成分的含量，结果见表1。

表1 栀子中两种成分测定结果

3 讨论

很多文献［5－6］报道多是单独测定栀子药材中栀子苷的含量，作为栀子质量控制的标准，但随着研究的深入，不断有新的药理活性被发现，而活性成分不仅只有栀子苷，吸收入血的有效成分还有去乙酰车叶草苷酸甲酯、山栀苷甲酯等，因为这些成分含量较低，含量测定存在一定的困难，我们建立了同时测定栀子中去乙酰车叶草苷酸甲酯、栀子苷含量的方法，为栀子资源的充分利用提供科学依据。

提取方法的选择，针对不同的提取方法(超声、回流提取)，不同提取溶剂(甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水)，不同提取时间(15 min、20 min、30 min、45 min、60 min)进行考察，最终选择50%甲醇超声提取30min可提取完全，与长时间提取结果相差较小。

流动相的选择，实验中用的流动相有乙腈－水，乙腈－0.1%磷酸水溶液，甲醇－水，甲醇－0.1%磷酸水溶液等，《中华人民共和国药典》2010年版一部栀子含量测定采用乙腈－水(15∶85)［7］作为流动相，经考察最终采用乙腈－0.1%磷酸水溶液梯度洗脱可使两种成分与相邻峰分离度均大于1.5，峰形较好。

［1］南京中医药大学.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，2006:2240－2243.

［2］Junsheng Tian，Yuanlu Cui，Limin Hu，et al.Antidepressant－ like effect of genipin in mice［J］.Neurosci.Lett，2010，479:236 －239.

［3］Yang Yu，Zuolei Xie，Weiwei Ma，et al.Bioactive Iridoid Glucosides from the Fruit of Gardenia jasminoides［J］.Nat.Prod，2009，72:1459–1464.

［4］Quanjun Yang，Bin Wu，Yujing Shi，et al.Bioactivity － guided Fractionation and Analysis of Compounds with Anti－influenza Virus Activity from Gardenia jasminoides Ellis［J］.Arch Pharm Res，2012，35:9 －17.

［5］黄青萍.高效液相法测定不同产地栀子中栀子甙的含量报道［J］.医学信息，2008，21(9):1706－1707.

［6］段起，庄义修，陈华师.高效液相色谱法测定不同产地栀子中栀子苷含量［J］.亚太传统医药，2009，5(6):20－21.

［7］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2010:173.