浅谈蜜环菌母种培养与转扩改革

杨辉德

(黄冈职业技术学院生物化工学院，湖北 黄冈 438002)

天麻是名贵中药材，现已由传统医用发展到饮食及滋补保健等行业，社会需求量急增，导致天麻种植的共生菌蜜环菌菌种生产量也与日俱增。但随着对蜜环菌生长习性认识的逐步深入，笔者发现蜜环菌母种生产中存在的一些问题。一是蜜环菌母种在斜面培养生长不理想;二是蜜环菌在琼脂培养基上极易产生褐化及角质化，使菌种发生退化;三是传统从试管表面转管与扩繁容易导致污染。上述问题均影响了制作蜜环菌母种的质量与转扩成功率。通过对上述问题的试验探索，在借鉴他人经验的基础上，进行大胆的探索与改革，很好地解决了上述问题，现总结如下。

1 蜜环菌母种的生产与转扩中存在的问题

在多年培养蜜环菌母种实践中，开始对蜜环菌不太了解，在培养基配制、试管分装、母种转管与扩繁中总按对待其它食用菌的办法进行操作，并没有考虑蜜环菌生长的个性要求。在实际生产中出现一些不尽人意的事情，如斜面培养菌种量过小、PDA培养基种性易退化、从试管表面接种易污染等问题。

1.1 试管斜面培养菌种量小

传统上蜜环菌母种采用试管斜面培养，主要考虑增加菌种与氧气的接触面积，通常是18 mm×180 mm试管装7 mL～8 mL，或20 mm×200 mm试管装10 mL～12 mL，所装高度只占试管1/5～1/4 之间。摆成斜面后高度占试管 1/2 ～3/5 之间，所装液量较少，培养母种量有限。

1.2 PDA培养基种性易退化

蜜环菌母种制作，不管是菌种制作厂家还是天麻种植者，大多采用传统的PDA、PDA加富或PDA+黄豆粉等培养基。这些传统培养基有许多不足之处一是不能为蜜环菌提供充分的营养来源;二是由于蜜环菌是喜湿性菌类，在培养基上更易吸收游离态水，而传统的琼脂培养基以结合态水为主要存在形式，不能很好地为其提供所需水分，致使蜜环菌的生长受到一定抑制;三是在琼脂培养基上，菌种容易产生褐化及角质化，这是蜜环菌退化的标志，因而影响了培养母种的质量，降低了天麻生产产量。

1.3 固体培养生长不理想

传统的蜜环菌母种培养均采用琼脂作凝固剂，这都源于对蜜环菌缺乏了解。蜜环菌是喜湿性菌类，更易于吸收游离态水，在琼脂作凝固剂中以白色菌索形式出现，但分枝较少;而在原料为主的半固体培养基中也以白色菌索形式出现，但分枝较多，生长更旺。

1.4 从试管表面接种易污染

在后期生长中，蜜环菌母种在菌柱表面分泌色素形成老菌皮，上面还形成菌索伸向试管口。因而从试管表面接种增加了接种操作难度，同时随着保藏时间的延长，母种菌柱上部会失水干缩并产生色素，这一部分菌种更容易出现退化问题;再者菌种在长期保藏中菌种表面可能有杂菌，致使从试管表面接种易污染，母种转管与扩繁成功率不高。

2 蜜环菌母种生产与转扩的改革方法

2.1改试管斜面为试管菌柱

由于蜜环菌母种能以菌索方式存在，菌索有输送氧气的能力。因此，蜜环菌母种培养可改用试管菌柱方式进行。试管菌柱制作减少了摆斜面的操作环节，菌柱高度与试管斜面同样只占试管1/2～3/5之间，用18 mm×180 mm试管装液量为18 mL～20 mL，20 mm×200 mm试管装液量23 mL～25 mL，装液量是试管斜面的2.5倍。试管菌柱培养的母种见图1，从而在同样的容器中提高了母种的生产数量，节约成本，提高效益。

2.2 改固体方式为半固体方式

使用玉米粉100 g、黄豆粉10 g、麦麸80 g、蔗糖 (白糖)20 g、水1 000 mL作培养蜜环菌母种的的配方。培养基的状态呈半固体状，具有流动性。先将称量好的玉米粉、黄豆粉、麦麸用适量水调匀。再添足水煮制，待煮沸时开始记时，保持35 min即可，注意在加热过程中需不时搅拌，以免煮糊。注意适量添水，以补充加热过程中损失的水分。煮好后加入所需的蔗糖，趁热采用注射筒或其他装置分装。分装后塞好棉塞，将试管竖直放置。由于该培养基营养相当丰富，再加上玉米粉彻底灭菌相对较难。因此灭菌时间应比常规培养基稍长一点，一般将其控制在高压条件下0.15 MPa下灭菌35 min～40 min。灭菌完成后，待冷却至试管不烫手时将其取出，竖直放置，待完全冷却后再开始接种操作。采用玉米粉等原料半固体方式培养的蜜环菌母种见图2。

2.3 改PDA培养基为综合培养基

用传统的PDA、PDA加富、PDA+黄豆粉等培养基培养蜜环菌母种，菌种呈菌索状，菌索生长粗状，分枝也多，在菌柱表面分泌的色素多，易形成褐化及角质化。而用马铃薯100 g、木屑 50 g、麦麸 50 g、玉米粉 50 g、琼脂 10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB110 mg、水1 000 mL的综合配方培养蜜环菌母种，培养的母菌呈菌丝状，菌丝分枝细密，生长势强，日平均生长速度达5.18 mm·d－1。且经1年时间保藏失水不严重、耐贮藏，与PDA培养基配母种质量有显著差异，在推广中增产明显。

2.4 改试管表面转扩为试管底部破碎转扩

鉴于蜜环菌母种从试管表面接种易污染的现实，笔者进行了多次改从试管底部破碎转扩试验，成功率高达98%。具体操作步骤如下:第一步挑选健壮的母种试管;第二步在试管下半部菌柱的部位用宽透明胶带缠绕并用75%酒精消毒;第三步在超净工作台或接种箱中敲碎管底，无菌操作中一只手拿试管口棉塞处，另一只手用镊子从试管底部破碎处挑取母菌进行转扩接种。操作步骤与操作方法见图3。

［1］肖波，韩如刚，韦会平．蜜环菌优质母种的简易制作［J］．农村实用科技，2003(10):31－32．

［2］熊鹰，姜邻，唐利民．蜜环菌母种培养基筛选试验［J］．中国食用菌，2004(5):25－26．

［3］王守现，刘宇，耿小丽，等．蜜环菌母种培养基筛选试验 ［J］．食用菌，2010(2):35－36．

［4］严庆海．蜜环菌培养基组分探讨 ［J］．怀化师专学报，1994(6):134－135．